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文檔簡介
1、 目的:研究大鼠肝星狀細(xì)胞中Samd1、P-Smad1及纖維化相關(guān)基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等的表達(dá)情況,探討B(tài)MP-7在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中如何拮抗TGF-β1,闡述其抗肝纖維化機(jī)制。
方法:(1) 體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6),采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將組成性激活化型BMP-7Ⅰ型受體突變體(ALK3-CA)的真核表達(dá)載體pcDNA3-HASL-ALK3轉(zhuǎn)染HSC-T6,用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)
2、(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)篩選克隆細(xì)胞株;(2) 四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-Dimethyl-thiaoly)-2,5-diphenyl-2H tet razolium bromide, MTT]法檢測(cè)高表達(dá)持續(xù)活化型ALK3后HSC-T6增殖;(3) RT-PCR檢測(cè)col1A2 等基因的mRNA表達(dá);(4)蛋白印跡(Western blott
3、ing,WB)法分別檢測(cè)Samd1、P-Smad1、E-cadherin、α-SMA、col1A2的表達(dá);高倍顯微鏡下觀察高表達(dá)持續(xù)活化型ALK3克隆細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)。
結(jié)果:(1) RT-PCR結(jié)果表明陽性克隆株細(xì)胞的α-SMA、col1A2、col3A1、col4A2 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào),而E-cadherin水平上調(diào)。(2) WB結(jié)果表明陽性細(xì)胞株P(guān)-Smad1、E-cadherin表達(dá)水平升高,α-SMA、col
4、1A2表達(dá)下降,Smad1未見明顯改變,以β-actin作為內(nèi)參照。(3) MTT法結(jié)果表明高表達(dá)持續(xù)活化型ALK3能抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的速度。與0h相比,當(dāng)培養(yǎng)24h時(shí)ALK3-16/T6和對(duì)照細(xì)胞3.1/T6增殖倍數(shù)分別為1.5和2.6倍;當(dāng)培養(yǎng)48h時(shí),對(duì)照細(xì)胞增殖倍數(shù)為4.3倍,而ALK3-16/T6細(xì)胞為1.7倍(*,P<0.05);隨著時(shí)間的延長,ALK3-16/T6細(xì)胞增殖速度較對(duì)照細(xì)胞要慢(*,P<0.05)。因此
5、高表達(dá)持續(xù)活化型ALK3受體后可抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖,并且具有時(shí)間依賴性。(4) 倒置顯微鏡下,對(duì)照組3.1/T6細(xì)胞呈單層生長,細(xì)胞多呈梭形排列,胞質(zhì)薄而透明,核橢圓;ALK3-16/T6細(xì)胞成多角形或蝌蚪形,胞質(zhì)飽滿,核圓大。
結(jié)論:成功獲得高表達(dá)持續(xù)活化型ALK3克隆細(xì)胞株,運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室各種技術(shù)方法結(jié)果提示BMP-7通過增強(qiáng)Samd1磷酸化水平而競(jìng)爭性拮抗TGF-β1致纖維化作用。BMP-7或者ALK3可作為臨床治
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