煙草茄尼醇合成途徑中dxps基因的克隆與表達(dá).pdf

1、茄尼醇是植物次生代謝產(chǎn)物中的一種萜類物質(zhì)，由于本身具有藥用價(jià)值，且是輔酶Q10的關(guān)鍵中間體，越來越受到人們的關(guān)注。茄尼醇廣泛存在于植物中，但含量甚微，其中桑葉、馬鈴薯葉、煙葉中的含量較高，煙葉中含量最高。茄尼醇在國際市場上供不應(yīng)求。
　　 煙草中茄尼醇的合成前提物異戊二烯焦磷酸主要來源于丙酮酸-3-磷酸甘油醛途徑，脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXPS)是其途徑中的關(guān)鍵酶。有實(shí)驗(yàn)表明，抑制脫氧木酮糖-5-磷酸合酶的合成可以減少其次生

2、代謝產(chǎn)物的含量。而導(dǎo)入外源的dxps基因則可增加該途徑中萜類物質(zhì)的含量。發(fā)狀根具有生長快、不需外源性生長激素、次生代謝物含量高和遺傳特性穩(wěn)定等，常被用來做生產(chǎn)次生代謝物的生物反應(yīng)器。因此，通過基因工程和細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合的方法探討提高茄尼醇含量的方法具有一定的研究意義。通過導(dǎo)入外源dxps基因，促使DXPS過量表達(dá)，再通過對發(fā)根的培養(yǎng)，從兩個(gè)方面提高茄尼醇的產(chǎn)量。具體方法如下：
　　 1.目的基因的獲得：提取擬南芥的總RNA，設(shè)計(jì)引

3、物，進(jìn)行RT-PCR，獲得目的基因dxps，與中間載體pMD19相連，在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，復(fù)制，測序。
　　 2.表達(dá)載體的構(gòu)建：重新設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，與pMD19分子連接，大腸桿菌轉(zhuǎn)化，復(fù)制；酶切，檢測，與pBI121載體相連，構(gòu)建好pBI121-pMD19dxps載體。通過凍融法轉(zhuǎn)入A4發(fā)根農(nóng)桿菌中。
　　 3.煙草發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)的建立：通過研究影響誘導(dǎo)發(fā)狀根的各種因素，確定最佳的轉(zhuǎn)化材料和轉(zhuǎn)化條件，建立高效的