異丁醇生物合成途徑中關(guān)鍵酶的克隆與表達(dá).pdf

1、異丁醇以高辛烷值、高能量密度、低蒸汽壓、低吸濕性等優(yōu)良特性成為新一代的生物燃料，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，生物合成異丁醇成為國內(nèi)外研究熱點。
　　本文首先通過PCR從枯草芽孢桿菌168基因組中獲得目標(biāo)基因alsS，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-alsS，從大腸桿菌MG1655基因組中分別獲得目標(biāo)基因ilvC、ilvD、yqhD，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-ilvC、pET22b(+)-ilvD、pET30a(+)-yqhD，并分

2、析重組質(zhì)粒在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)情況。結(jié)果表明分子量大小為62.8kDa的乙酰乳酸合成酶(AHAS)、54.1 kDa的乙酰乳酸異構(gòu)還原酶(AHAIR)、67.9kDa的二羥基酸脫水酶(DHAD)、42.7 kDa的脫氫酶(ADH)均得到有效表達(dá)，總蛋白分別為0.41、0.34、0.83、2.12 mg/mL，建立了乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸異構(gòu)還原酶的酶活分析方法，測得它們的粗酶液酶活分別為3.42和4.02 U/m

3、L。
　　其次，我們對異丁醇生物合成途徑中占據(jù)重要地位的乙酰乳酸合成酶的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳表達(dá)條件為在LB培養(yǎng)基中，37℃，200 rpm培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600=0.6-0.8)時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，30℃誘導(dǎo)6h，酶活最高可達(dá)24.4 U/mL，比優(yōu)化前提高了7.13倍。經(jīng)鎳柱親和層析后獲得電泳純的AHAS，比活達(dá)到95.3 U/mg，比未純化前提高了1.8倍。
　　最后，我們

4、比較了單質(zhì)粒雙順反子和雙質(zhì)粒雙抗性兩種模式下AHAS和AHAIR的共表達(dá)效果，發(fā)現(xiàn)雙質(zhì)粒雙抗性模式下蛋白表達(dá)量和兩個酶的酶活都要比單質(zhì)粒雙順反子模式下的高。隨后又研究了單質(zhì)粒雙順反子體系中SD序列對基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明兩個基因之間無SD序列時，兩個基因都無法正常表達(dá);兩個基因之間插入不同的SD序列時，第二個基因的表達(dá)水平會提高，第一個基因的表達(dá)水平會降低。在此基礎(chǔ)上我們在ilvD基因前添加GAAGGAGATATACAT作為SD序列將