重組α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化廢棄薯渣生產(chǎn)低聚異麥芽糖的研究.pdf

1、利用廢棄薯渣生產(chǎn)低聚異麥芽糖(Isomaltooligosaccharides)是一種新開發(fā)的薯渣資源化方法。低聚異麥芽糖具有獨(dú)特的生理功能而成為一種重要的功能性食品配料，在食品、醫(yī)療保健品行業(yè)和飼料工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 在考察廢棄薯渣生產(chǎn)低聚異麥芽糖的條件的基礎(chǔ)上，研究α-葡萄糖苷酶在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)重組酶催化轉(zhuǎn)化薯渣生產(chǎn)低聚異麥芽糖，本論文主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.對內(nèi)蒙古馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廠家

2、提供的廢棄薯渣進(jìn)行成分分析，脫水后薯渣中淀粉含量為38.96%.當(dāng)合用真菌α-淀粉酶、β-淀粉酶和普魯蘭酶，且添加量均為0.5 mL/(kg薯渣)，α-葡萄糖苷酶(amano)的添加量為0.05 mL/(kg薯渣)時(shí)，先糖化2h再轉(zhuǎn)苷24 h，生成的異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖含量最高，分別達(dá)到28.1%、13.0%和11.2%，三糖總含量為52.3%，表明廢棄薯渣可以被利用生產(chǎn)低聚異麥芽糖。
　　 2.提取黑曲霉(Aspergi

3、llus niger SG136)的總DNA，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Aspergillusniger CBS513.88的α-葡萄糖苷酶序列，合理設(shè)計(jì)八條引物，確定PCR條件，從基因組中克隆出四個(gè)外顯子，再用over-lap PCR方法將各個(gè)外顯子兩兩連接，完整準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出A.niger的α-葡萄糖苷酶基因(aglu)序列。
　　 3.對擴(kuò)增出的基因進(jìn)行堿基測序，aglu其共含有2880 bp，編碼960個(gè)氨基酸，基因長度與NCB

4、I中A.niger CBS513.88的aglu(登錄號:4991096)相同，編碼蛋白質(zhì)序列相比在第898位氨基酸有差異，A niger CBS513.88是脯氨酸，而A.niger SG136是絲氨酸。
　　 4.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K-aglu，經(jīng)Bgl II線性化后電轉(zhuǎn)化，通過對酵母重組子的G418篩選，獲得G418抗性濃度為2 mg/mL的α-葡萄糖苷酶基因工程菌Pichiapastoris KM71/pPIC

5、9K-ag/u，并經(jīng)PCR驗(yàn)證。搖瓶培養(yǎng)條件下，通過添加終濃度為1%的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，72 h發(fā)酵液經(jīng)非變性電泳為一條帶以及SDS-PAGE顯示兩條分子量分別為98 kDa和33 kDa的蛋白條帶，而對照中沒有相應(yīng)條帶。重組畢赤酵母KM71/pPIC9K-aglu在誘導(dǎo)培養(yǎng)120 h時(shí)測得α-葡萄糖苷酶的活性達(dá)到0.549U/mL。
　　 5.上述重組α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化麥芽糖生成低聚異麥芽糖的最適條件是pH5，55℃，當(dāng)反應(yīng)24