林麝Ⅱ類MHC基因分離與化膿性疾病的相關(guān)性研究.pdf

1、林麝是我國(guó)獸類中具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值的一種資源動(dòng)物。雄性林麝的麝香囊腺分泌的麝香在醫(yī)藥和香水行業(yè)具有非常重要的作用。近幾十年來(lái)，隨著國(guó)際市場(chǎng)對(duì)麝香的需求量不斷增加以及人為的亂捕亂獵和棲息地破壞，林麝的數(shù)量不斷下降，已到了鄰近滅絕的邊緣。人工養(yǎng)殖林麝已有50多年，但圈養(yǎng)林麝的種群因疾病等多種限制因素的困擾而發(fā)展緩慢。因此，非常有必要對(duì)這一物種展開科學(xué)研究，進(jìn)一步加大保護(hù)力度。
　　 主要組織相容性復(fù)合體(MajorHisto

2、compatibilityComplex，MHC)是脊椎動(dòng)物中多態(tài)性最高的一個(gè)超基因家族，其編碼的細(xì)胞膜表面蛋白在識(shí)別、呈遞外來(lái)抗原并引發(fā)下游免疫應(yīng)答反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，是脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。一個(gè)有功能的MHCⅡ類分子是由一個(gè)α鏈和一個(gè)β鏈非共價(jià)結(jié)合形成的二聚體，其分別由MHCⅡ的A基因和B基因編碼。MHCⅡ類A基因和B基因exon2編碼的抗原結(jié)合區(qū)具有非常高的多態(tài)性，與物種抵抗病原體的能力及適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)

3、境直接相關(guān)。本研究以四川養(yǎng)麝研究所的115只林麝個(gè)體為對(duì)象，通過(guò)對(duì)MHCⅡ類經(jīng)典的DR和DQ座位的分離、遺傳變異分析和化膿性疾病相關(guān)性的分析，揭示了林麝MHCⅡ基因多態(tài)性的維持機(jī)制及其與化膿性疾病的密切關(guān)系。主要的研究結(jié)果如下:
　　 1.利用通用引物獲得Mobe-DR基因部分exon2序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因組步移法結(jié)合長(zhǎng)程PCR法，成功地獲取了DR基因exon2序列兩側(cè)的內(nèi)含子序列，繼而成功地設(shè)計(jì)了座位特異性引物，并通過(guò)群體調(diào)

4、查結(jié)果證實(shí)了其有效性，最終獲得一個(gè)DRA座位，一個(gè)DRB座位(DRB3)。
　　 2.利用通用引物獲得Mobe-DQ基因部分exon2序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)長(zhǎng)程PCR法，成功地獲取了DQ基因完整的intron2序列。通過(guò)對(duì)長(zhǎng)片段序列的比對(duì)分析，依據(jù)同源序列設(shè)計(jì)引物，成功地獲取到部分intron1序列。所設(shè)DQ座位的特異性引物通過(guò)群體調(diào)查結(jié)果證實(shí)了其有效性。最終獲得了兩個(gè)DQA座位(DQA1&DQA2)和兩個(gè)DQB座位(DQB1&DQ

5、B2)。
　　 3.本研究一共獲得6個(gè)MHCⅡ經(jīng)典座位，利用座位特異性的PCR-SSCP基因分型和測(cè)序方法，最終分離到34條等位基因(DRA，4條;DRB3，10條;DQA1，4條;DQA2，7條;DQB1，4條;DQB2，5條)。林麝的6個(gè)MHCⅡ經(jīng)典座位均為多態(tài)，與其他瀕危的哺乳動(dòng)物相比較，林麝的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(MHCⅡ類)保留了較豐富的基因多樣性。
　　 4.林麝MHCⅡA基因經(jīng)研究表明均經(jīng)歷了凈化選擇，B基因則均

6、經(jīng)歷了正選擇，尤其是在B基因的抗原結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)歷了顯著的正選擇作用，表明不同的座位經(jīng)歷了不同的選擇壓力。此外，系統(tǒng)發(fā)育分析表明跨物種進(jìn)化是維持林麝各個(gè)座位基因多態(tài)性的主要機(jī)制之一。
　　 5.通過(guò)對(duì)化膿性疾病易感個(gè)體和抗病個(gè)體MHCⅡ各個(gè)座位上基因型和等位基因數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與林麝化膿性疾病相關(guān)的等位基因一共有9條，其中4條等位基因(Mobe-DQA1*01，Mobe-DQA1*02，Mobe-DQA2*03和Mobe-DQB2

7、*04)與化膿性疾病的抗性顯著相關(guān)，有5條等位基因(Mobe-DRB3*07，Mobe-DQA1*03(orMobe-DQA1*04)和Mobe-DQA2*05(orMobe-DQA2*06)與化膿性疾病的易感性顯著相關(guān)。與化膿疾病相關(guān)的基因型一共有13個(gè)，其中與抗性相關(guān)的基因型有6個(gè)(DRB3*01/03，DQA1*01/01，DQA1*01/02，DQA2*01/03，DQA2*02/04與DQB2*03/04(P＜0.05));與

8、易感相關(guān)的基因型有7個(gè)(DRB3*07/07,DQA1*03/03,DQA2*01/01,DQA2*05/05,DQA2*05/06,DQB1*01/03與DQB2*01/02(P＜0.05))。此外，利用各個(gè)座位上等位基因的抗原結(jié)合區(qū)形成的不同單倍型及其基因型數(shù)據(jù)，通過(guò)分析獲得與化膿性疾病相關(guān)的超級(jí)單倍型一共有6條，單倍型H1(DRA*h1/DRB3*h1/DQA1*h1/DQA2*h2/DQB1*h1/DQB2*h2)與H2(DRA

9、*h1/DRB3*h4/DQA1*h1/DQA2*h2/DQB1*h1/DQB2*h1)與化膿性疾病的抗性相關(guān)，單倍型H3(DRA*1/DRB3*h1/DQA1*h3/DQA2*h3/DQB1*h3/DQB2*h2),H4(DRA*h1/DRB3*h5/DQA1*h3/DQA2*h3/DQB1*h1/DQB2*h1),H5(DRA*h1/DRB3*h7/DQA1*h3/DQA2*h1/DQB1*h3/DQB2*h2)與H6(DRA*h1

10、/DRB3*h7/DQA1*h3/DQA2*h3/DQB1*h1/DQB2*h1)則與化膿性疾病的易感性相關(guān)。推斷Mobe-DRA*02及與其相關(guān)的基因型在抗病組具有極高的頻率，因Mobe-DRA*02與大部分的超級(jí)單倍型連鎖，尤其是抗病的超級(jí)單倍型連鎖所致;同時(shí)，Mobe-DRA*03和Mobe-DRA*04的抗原結(jié)合區(qū)雖然與Mobe-DRA*02完全一致，二者因與易感的超級(jí)單倍型連鎖，致使其本身和與之相關(guān)的基因型在易感組的頻率較高。

11、Mobe-DQB2*02和Mobe-DQB2*03的抗原結(jié)合區(qū)完全一致，二者亦因分別與易感的和抗病的超級(jí)單倍型連鎖而在易感組和抗病組中的等位基因頻率較高。
　　 易感等位基因、基因型與超級(jí)單倍型數(shù)目均多于抗病的等位基因和基因型數(shù)目，暗示圈養(yǎng)林麝易患化膿性疾病確與群體中這些易感等位基因、基因型與超級(jí)單倍型有著密切的關(guān)系。建議適時(shí)地引入新的種源，防止近交引起的易感等位基因的純合子和雜合子在群體中的數(shù)目繼續(xù)增多，使種源衰退進(jìn)一步惡化。