相關(guān)基因多態(tài)性與甲氨蝶呤治療風(fēng)濕性疾病療效及不良反應(yīng)的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：①研究中國(guó)風(fēng)濕性疾病患者群中MDR1C3435T、RFC1 G80A、GGH C—401T、FPGS(rs1544105)G>A、MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因型的分布，并與其他種族進(jìn)行比較，明確種族差異。②建立LC/MS/MS分析法測(cè)定人血紅細(xì)胞中甲氨蝶呤谷氨酸聚合物濃度。③分析紅細(xì)胞內(nèi)MTXPGs濃度和MTX治療風(fēng)濕性疾病療效、不良反應(yīng)間的相關(guān)性，探討MTX轉(zhuǎn)運(yùn)代謝作用通路上的MDR1C3435T、RFC

2、1 G80A、GGH C—401T、FPGS(rs1544105)G>A、MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因多態(tài)性對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPGs濃度和對(duì)MTX治療風(fēng)濕性疾病療效及不良反應(yīng)的影響。 方法：⑴用PCR—RFLP的方法檢測(cè)分析MDR13435、RFC180、GGH—401、FPGS(rs1544105)、MTHFR677和MTHFR1298五個(gè)基因6個(gè)位點(diǎn)在中國(guó)風(fēng)濕患者群中的分布情況，并驗(yàn)證是否符合Hardy

3、—Weinberg平衡，同時(shí)和其他種族基因突變頻率與等位基因頻率的分布進(jìn)行比較。⑵采用液質(zhì)聯(lián)用電噴霧檢測(cè)法(LC/MS/MS)。全血經(jīng)VitaminC37℃孵育3h得到甲氨蝶呤總濃度，不經(jīng)Vitamin C孵育處理的即為原型甲氨蝶呤濃度，全血甲氨蝶呤谷氨酸聚合物濃度=總甲氨蝶呤濃度—原型甲氨蝶呤濃度。再根據(jù)體積比換算為紅細(xì)胞內(nèi)甲氨蝶呤谷氨酸聚合物的濃度。提取方法用液液萃取的方法，先用三氟乙酸蛋白沉淀，再用乙酸乙酯提取。樣品經(jīng)電噴霧離子源

4、正離子化后，通過(guò)三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)對(duì)甲氨蝶呤(m/z455.2→308.2)和內(nèi)標(biāo)多索茶堿(m/z267.2→181.2)進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為Ultimate XB—C18柱，流動(dòng)相為乙腈(1％甲酸)/甲酸銨水溶液(20 mM)＝30:70，流速為0.2mL/min，柱溫為25℃，每個(gè)樣品的分析時(shí)間為3min。⑶用PCR—RFLP法檢測(cè)MDR1、RFC1、GGH、FPGS和MTHFR基因多態(tài)性，用LC/MS/M

5、S法檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPGs濃度，用Phase2.1軟件分析MTHFR單倍型。用x2檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)、多重線(xiàn)性回歸、Logistic回歸等分析方法分析各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)間的相關(guān)性。 結(jié)果：①6個(gè)位點(diǎn)等位基因頻率如下：MDR13435C64％，MDR13435T36％；RFC180G51％,RFC180A49％；GGH—401C81％,GGH—401T19％；FPGS(rs1544105)G26％, FPGS(rs1544105)A74

6、％；MTHFR677C73％, MTHFR677T27％；MTHFR1298A79％，MTHFR1298C21％。各個(gè)基因型都符合Hardy—Weinberg平衡。②MTX血藥濃度在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r2均大于0.99)，分析方法的最低檢測(cè)限為0.5 ng/mL。其高、中、低(50、10、2 ng/mL)3種濃度在全血及孵育全血中的平均提取回收率在26.2％～37.8％之間，方法回收率在99.1％-108.4％之

7、間。日內(nèi)(n=5)、日間(n=3)精密度RSD均<15％。各項(xiàng)穩(wěn)定性考察符合FDA的有關(guān)要求。③紅細(xì)胞內(nèi)MTXPGs濃度和RA患者療效存在相關(guān)性，濃度大于25 nmol/L患者療效較好。④RFC180和GGH—401位突變對(duì)胞內(nèi)MTXPGs濃度的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RFC180純合型和GGH—401野生型個(gè)體胞內(nèi)MTXPGs水平較高。⑤RA患者：?jiǎn)我蛩胤治鯩TX療程對(duì)VASb、HAQb和TJCb都有顯著影響，用藥持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，療效越好。M

8、DR1、GGH分別與VASb和TJCb有相關(guān)性，攜帶MDR13435純合型個(gè)體療效較好，GGH—401野生型個(gè)體療效好。MDR13435純合型分布在療效好組明顯比療效差組多。經(jīng)多重線(xiàn)性回歸和Logistic回歸分析，再次驗(yàn)證用藥持續(xù)時(shí)間、RFC1、GGH對(duì)療效各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)有貢獻(xiàn)，影響大小不一。⑥ AS患者：?jiǎn)我蛩胤治鲋坏玫侥挲g對(duì)療效有影響，年齡越大，療效越差；MDR13435純合型在療效好組分布頻率高。經(jīng)多重線(xiàn)性回歸分析，也只有年齡和M

9、DR1基因型對(duì)療效的差異有貢獻(xiàn)。經(jīng)Logistic回歸分析，MTHFR1298純合型個(gè)體療效較好。⑦對(duì)不良反應(yīng)的分析發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T與不良反應(yīng)的相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，突變型在不良反應(yīng)組分布頻率較高，提示MTHFR677突變型可能是不良反應(yīng)的危險(xiǎn)因素。攜帶677T-1298A單倍型個(gè)體更容易發(fā)生不良反應(yīng)。 結(jié)論：⑴除了MTHFR677的突變頻率較低外，本研究風(fēng)濕患者群中的各基因頻率與已報(bào)道的北京健康志愿者基因頻率相似。各基

10、因頻率與其他種族間存在種族差異。⑵本方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于MTX的臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)、藥動(dòng)學(xué)研究。⑶紅細(xì)胞內(nèi)MTXPGs濃度和RA患者療效存在相關(guān)性，濃度大于25 nmol/L患者療效較好。RFC180G>A及GGH—401C>T對(duì)胞內(nèi)MTXPGs濃度、RA患者療效的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，RFC180純合型個(gè)體和GGH—401野生型個(gè)體胞內(nèi)MTXPGs水平較高，療效較好。MDR13435純合型個(gè)體療效較好。RFC180、