鼻咽癌順鉑耐藥細胞系的建立及耐藥蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、研究背景
　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我國南方最常見的惡性腫瘤之一,絕大多數(shù)NPC分化差,惡性程度高,易早期發(fā)生頸淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移。目前,鼻咽癌的臨床治療主要以放療和化療為主,5年生存率約50％-70％之間。中晚期NPC臨床療效差,再加上在鼻咽癌治療過程中往往會出現(xiàn)多藥耐藥性(multi-drug resistance,MDR),而導致化療失敗。因此,研究鼻咽癌耐藥的分子機制很有必要。<

2、br>　　MDR是指惡性腫瘤細胞在接觸一種抗癌藥后,產(chǎn)生了對多種結(jié)構(gòu)不同、作用機制各異的其他抗癌藥的耐藥性。MDR是惡性腫瘤化療失敗和復發(fā)的重要原因之一,涉及到多種復雜的分子機制,其中,以多藥耐藥相關蛋白(multi-drug resistance protein,MRP)在抗癌藥物耐藥中所起的作用備受重視。
　　比較耐藥腫瘤細胞與其對應的親本腫瘤細胞之間差異表達的蛋白質(zhì),可以發(fā)現(xiàn)與耐藥相關的蛋白質(zhì),為篩選腫瘤耐藥的分子標志物及腫

3、瘤耐藥的靶向治療提供了新的研究方向。
　　第一章鼻咽癌順鉑耐藥細胞系的建立
　　目的:本研究通過順鉑(cis-Diammine-Dichloro-Platinum,cDDP)濃度遞增法建立了鼻咽癌耐藥的細胞株CNE2/cDDP,并研究其生物學行為。方法:采用cDDP濃度遞增法,經(jīng)過3個月左右的時間建立了鼻咽癌順鉑耐藥細胞系CNE2/cDDP,倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察,MTT檢測不同細胞系的耐藥性。結(jié)果:MTT實驗研究發(fā)現(xiàn)在不

4、同藥物(順鉑、長春新堿、卡鉑、紫杉醇、5-FU)作用下,CNE2/cDDP較CNE2的IC50值及耐藥指數(shù)均有明顯的增加,CNE2/cDDP細胞對順鉑的耐藥性最強,增加到200.6倍,對5-Fu的耐藥性最差,增加到2.8倍;耐藥細胞株CNE2/cDDP較非耐藥細胞株CNE2生長速度減慢,其細胞倍增時間由18小時增加到24小時;CNE2/cDDP細胞體積較CNE2為小,常呈克隆聚集現(xiàn)象。結(jié)論:CNE2/cDDP不光對順鉑具有耐藥性,對其他

5、化療藥物也具有不同的耐藥性,即具有MDR,并且該細胞系性狀穩(wěn)定,可穩(wěn)定地傳代和保存,是一個理想的用于鼻咽癌的多藥耐藥研究的細胞系,為下一步蛋白質(zhì)組學研究提供了基礎。
　　第二章鼻咽癌順鉑耐藥細胞系的耐藥蛋白質(zhì)組學研究及耐藥關鍵蛋白功能研究
　　目的:本研究通過蛋白質(zhì)組學方法分離鑒定鼻咽癌耐藥細胞系的差異表達蛋白,并對其中的關鍵蛋白keratin1進行功能研究,以揭示keratin1在鼻咽癌耐藥中的作用。方法:采用2-DE+M

6、ALDI-TOF-MS進行鑒定,獲得了鼻咽癌順鉑耐藥的差異表達譜;并對其中的三個關鍵耐藥蛋白(KRT1,CTSD,ANXA5)表達水平進行western blot驗證;通過siRNA干擾KRT1表達后,觀察KRT1與鼻咽癌耐藥性的關系。結(jié)果:蛋白質(zhì)組學方法獲得了鼻咽癌細胞株CNE2與其順鉑耐藥細胞株CNE2/cDDP的差異蛋白表達譜,并鑒定了其中的17個差異表達蛋白,包括:角蛋白1,角蛋白18,膜聯(lián)蛋白A5,組織蛋白酶D,cDNAFLJ

7、52723,ME2(轉(zhuǎn)移抑制蛋白),3,2-反式-烯酰輔酶A異構(gòu)酶,組蛋白2B,熱休克蛋白β-1,3-羥氨基-輔酶a脫氫酶-2,丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶,谷氨酸脫氫酶1,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運ATPase,α-烯醇酶,熱休克蛋白90α,NADH脫氫酶,核內(nèi)核糖體蛋白C1/C2等。這些蛋白功能涉及到:細胞骨架,基因組穩(wěn)定,分子伴侶,代謝相關酶,轉(zhuǎn)運相關信號通路,蛋白合成和轉(zhuǎn)移相關信號通路等。其中三個蛋白KRT1,CTSD,ANXA5在耐藥細胞株中CNE2/cD

8、DP中的表達水平均明顯上調(diào),與蛋白質(zhì)組學鑒定的結(jié)果是一致的,說明蛋白質(zhì)組學方法鑒定獲得的差異蛋白表達譜是可靠的;keratin1在CNE2/cDDP中表達高于CNE2,siRNA下調(diào)keratin1表達后,可以顯著性減少鼻咽癌細胞株對五種化療藥物的IC50值,增加鼻咽癌細胞對化療藥物的敏感性;當siRNA下調(diào)keratin1表達后,多藥耐藥蛋白(MRP)的表達也下調(diào),說明keratin1表達與MRP表達具有相關性;keratin1表達下

9、調(diào)引起鼻咽癌細胞中MRP表達下調(diào),從而引起鼻咽癌細胞的耐藥性降低。結(jié)論:1.2-DE結(jié)合質(zhì)譜獲得了鼻咽癌順鉑耐藥的差異蛋白表達譜;2.獲得了17個與鼻咽癌順鉑耐藥有關的差異表達蛋白,這些蛋白功能涉及到細胞骨架、基因組穩(wěn)定、分子伴侶、代謝相關酶、轉(zhuǎn)運相關信號通路、蛋白合成和轉(zhuǎn)移相關信號通路等;3.KRT1,CTSD,ANXA5經(jīng)驗證與鼻咽癌順鉑耐藥有關;4.KRT1表達下調(diào)可導致鼻咽癌細胞株對順鉑、長春新堿、卡鉑、紫杉醇、5-FU的耐藥性