卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞系的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景和目的： 卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第三位，而死亡率居第一位。5年生存率僅為15-20％。腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成卵巢癌5年生存率低的一個重要原因。 已知的卵巢癌耐藥機(jī)制包括：1)化學(xué)物質(zhì)外流使腫瘤細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)濃度降低。涉及的耐藥基因和蛋白包括，MDR1，MRP和LRP等；2)腫瘤細(xì)胞對于抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)化和解毒功能增強(qiáng)，涉及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTS)和P450家族等；3)化學(xué)藥物作用靶分子的改變，如

2、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、二氫葉酸還原酶等；4)DNA損傷修復(fù)功能加強(qiáng)，如MGMT活性增強(qiáng)；5)化療藥物不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，涉及的基因包括P53和Bcl-2家族等。 從理論上來說，耐藥相關(guān)基因在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)該能夠預(yù)測腫瘤耐藥和預(yù)后，然而目前多數(shù)研究表明耐藥相關(guān)基因在卵巢癌的表達(dá)并不能良好地預(yù)測腫瘤的耐藥和預(yù)后。腫瘤的發(fā)生需要細(xì)胞核和細(xì)胞漿的共同參與。細(xì)胞核基因組中的癌基因的表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的主要原因，但有實驗表明將非腫瘤細(xì)胞的

3、細(xì)胞漿與腫瘤細(xì)胞融和能夠使腫瘤的表現(xiàn)得到抑制，說明細(xì)胞核外存在著抑癌因素。線粒體是普遍存在于真核動物的一個重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化，產(chǎn)生ATP的主要場所，內(nèi)含有染色體以外唯一的DNA，并能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯；而且MtDNA可影響腫瘤細(xì)胞的抑瘤性。在上述卵巢癌的5種耐藥機(jī)制中，至少有3種和線粒體相關(guān)：如化療藥物外流使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低的機(jī)制，腫瘤細(xì)胞對于抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)化和解毒功能增強(qiáng)的機(jī)制以及化療藥物不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。所以選

4、擇線粒體為研究對象。 蛋白質(zhì)組學(xué)水平可以從蛋白質(zhì)水平觀察相應(yīng)研究對象蛋白表達(dá)水平的變化，檢測蛋白翻譯后的修飾，同時找出與腫瘤耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)群，從而為尋找腫瘤標(biāo)記物及腫瘤的早期診斷提供了極大的可能性。對于以蛋白質(zhì)為主要成分的線粒體而言，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)該能夠更加全面地分析和研究線粒體蛋白和卵巢癌耐藥的相關(guān)性，同時為臨床尋找克服腫瘤耐藥性的靶點提供了新的途徑。 本研究在認(rèn)識卵巢癌耐藥相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，以卵巢上皮癌一線化

5、療藥物紫杉醇耐藥細(xì)胞系為研究對象，采用反復(fù)差速離心法分別提取紫杉醇敏感和耐藥細(xì)胞系的線粒體，并用電鏡和Western Blot法進(jìn)行鑒定；提取線粒體蛋白，應(yīng)用胍基化修飾的乙?；€(wěn)定同位素標(biāo)記、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)合制備紫杉醇敏感和耐藥細(xì)胞系的線粒體蛋白質(zhì)的表達(dá)譜和尋找差異表達(dá)蛋白。 研究內(nèi)容和方法： 1．紫杉醇耐藥細(xì)胞系SKOV3-TR、A2780TR耐藥性的檢測及化療藥物對線粒體膜電位的影響。對卵巢癌敏感細(xì)胞系SKOV3、

6、A2780，以及其相應(yīng)的紫杉醇耐藥細(xì)胞系SKOV3-TR、A2780TR，培養(yǎng)并用CCK法檢測耐藥細(xì)胞系的耐藥指數(shù)。運用JC-1染料結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)和熒光電鏡技術(shù)對上述細(xì)胞系進(jìn)行在不同紫杉醇濃度下線粒體膜電位檢測，對不同細(xì)胞系的線粒體功能和對紫杉醇作用下線粒體功能的改變進(jìn)行初探。 2．優(yōu)化細(xì)胞系線粒體蛋白質(zhì)提取技術(shù)。分別采用試劑盒裂解法、經(jīng)典的差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法和反復(fù)差速離心法分別提取紫杉醇敏感細(xì)胞SKOV3、A2

7、780和其耐藥細(xì)胞的線粒體，并用電鏡和Western Blot法進(jìn)行鑒定。 3．卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和A2780的線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的制備和卵巢癌紫杉醇化療敏感與耐藥細(xì)胞系線粒體的比較蛋白質(zhì)組分析。首次采用胍基化修飾的乙?；€(wěn)定同位素標(biāo)記法、液相色譜-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組策略制備卵巢癌細(xì)胞線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜，經(jīng)過比較蛋白質(zhì)學(xué)分析尋找差異表達(dá)蛋白。 研究結(jié)果： 1．本

8、實驗所用紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞系尚保持良好的耐藥性，并且保持原有的細(xì)胞形態(tài)特點，耐藥指數(shù)在SKOV3紫杉醇耐藥細(xì)胞系和A2780紫杉醇耐藥系分別為18.34±4.31和5.37±4.26。用熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測均可發(fā)現(xiàn)在紫杉醇為25μM時可造成線粒體膜電位的改變，但用流式細(xì)胞儀定量檢測發(fā)現(xiàn)：在SKOV3紫杉醇敏感細(xì)胞系在藥物濃度達(dá)到25μM時，線粒體膜電位有顯著改變(P<0.01)，而在此濃度，耐藥細(xì)胞系線粒體膜電位的改變尚未

9、達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性。 2．本實驗比較了裂解法、經(jīng)典的差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法以及優(yōu)化的反復(fù)差速離心法提取線粒體的效果，并且經(jīng)電鏡觀察加以驗證。從電鏡結(jié)果可以看出，試劑盒裂解法線粒體無正常形態(tài)，破碎、斷裂，僅剩雙層膜碎片，線粒體純度僅在40-50％。比較反復(fù)差速離心法和差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法，二者均能獲得完整的線粒體，純度可達(dá)到70％。比較二者線粒體蛋白的獲得率，反復(fù)差速離心法用于SKOV3-TR及SKOV3細(xì)胞系

10、，獲取1mg線粒體蛋白質(zhì)，需2×10<'8>個細(xì)胞；用于A2780-TR及A2780細(xì)胞系，獲取1mg線粒體，約需3-4×10<'8>個細(xì)胞方。采用反復(fù)差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法，同樣細(xì)胞量僅能提到約200-300ug的線粒體，且重復(fù)性較反復(fù)差速離心法差。因此，本實驗最終采用反復(fù)差速離心法獲得卵巢癌紫杉醇耐藥和敏感細(xì)胞系的線粒體蛋白質(zhì)，并以western blot方法對線粒體特異性蛋白抗體COX4、細(xì)胞核蛋白抗體Lamin-B、膜

11、蛋白抗體Flotillin-1、胞漿骨架系統(tǒng)蛋白抗體β-actin等對線粒體的純度進(jìn)行鑒定，表明基本沒有大量的胞漿、胞膜和胞核的污染。 3．首次運用胍基化修飾的乙酰化穩(wěn)定同位素標(biāo)記法、液相色譜一傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組策略，分別制備卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和A2780的線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜。共鑒定出780個蛋白，兩組細(xì)胞所共有的240個。鑒定蛋白的等電點(isoelectric point

12、，PI)范圍從4.09～11.36，PI>10的蛋白有9個，>8的蛋白達(dá)70個；分子量(molecular weight，Mw)范圍從7.6kD至346kD。 建立表達(dá)譜的同時，對兩組細(xì)胞(SKOV3/SKOV3-TR、A2780/A2780-TR)進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析以尋找在兩種不同的卵巢上皮癌細(xì)胞系中，耐藥細(xì)胞株和敏感細(xì)胞株的差異表達(dá)蛋白。結(jié)果找出共同上調(diào)或下調(diào)的蛋白8個(>2倍)，有共同上調(diào)或下調(diào)趨勢的蛋白28個(>1.

13、5倍)。其中線粒體蛋白Mimitin(myc indtmed mitochondriaprotein)為顯著下調(diào)蛋白，是癌基因MYC作用產(chǎn)生的蛋白，有望成為耐藥相關(guān)候選蛋白。 結(jié)論： 1．本實驗所用紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞株尚保持良好的耐藥性，并且保持原有的細(xì)胞形態(tài)特點。實驗結(jié)果表明，紫杉醇可以引起線粒體膜電位的改變。卵巢癌細(xì)胞系體外經(jīng)過紫杉醇作用誘導(dǎo)耐藥后，引起其線粒體膜電位的改變的藥物劑量應(yīng)較化療敏感的細(xì)胞株高，線粒體

14、可能是耐藥的靶點之一。 2．反復(fù)差速離心法與差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法均可獲得較高純度的細(xì)胞系線粒體蛋白質(zhì)。但前一種方法的線粒體獲得率高，可重復(fù)性好。經(jīng)westernblot正反相驗證，基本沒有大量胞膜、胞漿和胞核成分的混雜。 3．運用胍基化修飾的乙酰化穩(wěn)定同位素標(biāo)記法聯(lián)合液相色譜、質(zhì)譜分析技術(shù)制備卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和A2780的線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜獲得成功。經(jīng)過比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，兩種細(xì)胞細(xì)胞系有8個共同