卵巢癌紫杉醇耐藥細胞系的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景和目的： 卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第三位，而死亡率居第一位。5年生存率僅為15-20％。腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成卵巢癌5年生存率低的一個重要原因。 已知的卵巢癌耐藥機制包括：1)化學(xué)物質(zhì)外流使腫瘤細胞內(nèi)物質(zhì)濃度降低。涉及的耐藥基因和蛋白包括，MDR1，MRP和LRP等；2)腫瘤細胞對于抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)化和解毒功能增強，涉及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTS)和P450家族等；3)化學(xué)藥物作用靶分子的改變，如

2、拓撲異構(gòu)酶Ⅱ、二氫葉酸還原酶等；4)DNA損傷修復(fù)功能加強，如MGMT活性增強；5)化療藥物不能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，涉及的基因包括P53和Bcl-2家族等。 從理論上來說，耐藥相關(guān)基因在卵巢癌細胞中的表達應(yīng)該能夠預(yù)測腫瘤耐藥和預(yù)后，然而目前多數(shù)研究表明耐藥相關(guān)基因在卵巢癌的表達并不能良好地預(yù)測腫瘤的耐藥和預(yù)后。腫瘤的發(fā)生需要細胞核和細胞漿的共同參與。細胞核基因組中的癌基因的表達被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的主要原因，但有實驗表明將非腫瘤細胞的

3、細胞漿與腫瘤細胞融和能夠使腫瘤的表現(xiàn)得到抑制，說明細胞核外存在著抑癌因素。線粒體是普遍存在于真核動物的一個重要的細胞器，是細胞進行氧化磷酸化，產(chǎn)生ATP的主要場所，內(nèi)含有染色體以外唯一的DNA，并能進行轉(zhuǎn)錄和翻譯；而且MtDNA可影響腫瘤細胞的抑瘤性。在上述卵巢癌的5種耐藥機制中，至少有3種和線粒體相關(guān)：如化療藥物外流使腫瘤細胞內(nèi)藥物濃度降低的機制，腫瘤細胞對于抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)化和解毒功能增強的機制以及化療藥物不能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。所以選

4、擇線粒體為研究對象。 蛋白質(zhì)組學(xué)水平可以從蛋白質(zhì)水平觀察相應(yīng)研究對象蛋白表達水平的變化，檢測蛋白翻譯后的修飾，同時找出與腫瘤耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)群，從而為尋找腫瘤標(biāo)記物及腫瘤的早期診斷提供了極大的可能性。對于以蛋白質(zhì)為主要成分的線粒體而言，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)該能夠更加全面地分析和研究線粒體蛋白和卵巢癌耐藥的相關(guān)性，同時為臨床尋找克服腫瘤耐藥性的靶點提供了新的途徑。 本研究在認(rèn)識卵巢癌耐藥相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，以卵巢上皮癌一線化

5、療藥物紫杉醇耐藥細胞系為研究對象，采用反復(fù)差速離心法分別提取紫杉醇敏感和耐藥細胞系的線粒體，并用電鏡和Western Blot法進行鑒定；提取線粒體蛋白，應(yīng)用胍基化修飾的乙酰化穩(wěn)定同位素標(biāo)記、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)合制備紫杉醇敏感和耐藥細胞系的線粒體蛋白質(zhì)的表達譜和尋找差異表達蛋白。 研究內(nèi)容和方法： 1．紫杉醇耐藥細胞系SKOV3-TR、A2780TR耐藥性的檢測及化療藥物對線粒體膜電位的影響。對卵巢癌敏感細胞系SKOV3、

6、A2780，以及其相應(yīng)的紫杉醇耐藥細胞系SKOV3-TR、A2780TR，培養(yǎng)并用CCK法檢測耐藥細胞系的耐藥指數(shù)。運用JC-1染料結(jié)合流式細胞技術(shù)和熒光電鏡技術(shù)對上述細胞系進行在不同紫杉醇濃度下線粒體膜電位檢測，對不同細胞系的線粒體功能和對紫杉醇作用下線粒體功能的改變進行初探。 2．優(yōu)化細胞系線粒體蛋白質(zhì)提取技術(shù)。分別采用試劑盒裂解法、經(jīng)典的差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法和反復(fù)差速離心法分別提取紫杉醇敏感細胞SKOV3、A2

7、780和其耐藥細胞的線粒體，并用電鏡和Western Blot法進行鑒定。 3．卵巢癌細胞系SKOV3和A2780的線粒體蛋白質(zhì)表達譜的制備和卵巢癌紫杉醇化療敏感與耐藥細胞系線粒體的比較蛋白質(zhì)組分析。首次采用胍基化修飾的乙?；€(wěn)定同位素標(biāo)記法、液相色譜-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組策略制備卵巢癌細胞線粒體蛋白質(zhì)表達譜，經(jīng)過比較蛋白質(zhì)學(xué)分析尋找差異表達蛋白。 研究結(jié)果： 1．本

8、實驗所用紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞系尚保持良好的耐藥性，并且保持原有的細胞形態(tài)特點，耐藥指數(shù)在SKOV3紫杉醇耐藥細胞系和A2780紫杉醇耐藥系分別為18.34±4.31和5.37±4.26。用熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測均可發(fā)現(xiàn)在紫杉醇為25μM時可造成線粒體膜電位的改變，但用流式細胞儀定量檢測發(fā)現(xiàn)：在SKOV3紫杉醇敏感細胞系在藥物濃度達到25μM時，線粒體膜電位有顯著改變(P<0.01)，而在此濃度，耐藥細胞系線粒體膜電位的改變尚未

9、達到統(tǒng)計學(xué)顯著性。 2．本實驗比較了裂解法、經(jīng)典的差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法以及優(yōu)化的反復(fù)差速離心法提取線粒體的效果，并且經(jīng)電鏡觀察加以驗證。從電鏡結(jié)果可以看出，試劑盒裂解法線粒體無正常形態(tài)，破碎、斷裂，僅剩雙層膜碎片，線粒體純度僅在40-50％。比較反復(fù)差速離心法和差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法，二者均能獲得完整的線粒體，純度可達到70％。比較二者線粒體蛋白的獲得率，反復(fù)差速離心法用于SKOV3-TR及SKOV3細胞系

10、，獲取1mg線粒體蛋白質(zhì)，需2×10<'8>個細胞；用于A2780-TR及A2780細胞系，獲取1mg線粒體，約需3-4×10<'8>個細胞方。采用反復(fù)差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法，同樣細胞量僅能提到約200-300ug的線粒體，且重復(fù)性較反復(fù)差速離心法差。因此，本實驗最終采用反復(fù)差速離心法獲得卵巢癌紫杉醇耐藥和敏感細胞系的線粒體蛋白質(zhì)，并以western blot方法對線粒體特異性蛋白抗體COX4、細胞核蛋白抗體Lamin-B、膜

11、蛋白抗體Flotillin-1、胞漿骨架系統(tǒng)蛋白抗體β-actin等對線粒體的純度進行鑒定，表明基本沒有大量的胞漿、胞膜和胞核的污染。 3．首次運用胍基化修飾的乙酰化穩(wěn)定同位素標(biāo)記法、液相色譜一傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜和定量分析軟件MSAQ聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組策略，分別制備卵巢癌細胞系SKOV3和A2780的線粒體蛋白質(zhì)表達譜。共鑒定出780個蛋白，兩組細胞所共有的240個。鑒定蛋白的等電點(isoelectric point

12、，PI)范圍從4.09～11.36，PI>10的蛋白有9個，>8的蛋白達70個；分子量(molecular weight，Mw)范圍從7.6kD至346kD。 建立表達譜的同時，對兩組細胞(SKOV3/SKOV3-TR、A2780/A2780-TR)進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析以尋找在兩種不同的卵巢上皮癌細胞系中，耐藥細胞株和敏感細胞株的差異表達蛋白。結(jié)果找出共同上調(diào)或下調(diào)的蛋白8個(>2倍)，有共同上調(diào)或下調(diào)趨勢的蛋白28個(>1.

13、5倍)。其中線粒體蛋白Mimitin(myc indtmed mitochondriaprotein)為顯著下調(diào)蛋白，是癌基因MYC作用產(chǎn)生的蛋白，有望成為耐藥相關(guān)候選蛋白。 結(jié)論： 1．本實驗所用紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞株尚保持良好的耐藥性，并且保持原有的細胞形態(tài)特點。實驗結(jié)果表明，紫杉醇可以引起線粒體膜電位的改變。卵巢癌細胞系體外經(jīng)過紫杉醇作用誘導(dǎo)耐藥后，引起其線粒體膜電位的改變的藥物劑量應(yīng)較化療敏感的細胞株高，線粒體

14、可能是耐藥的靶點之一。 2．反復(fù)差速離心法與差速離心聯(lián)合非連續(xù)密度梯度離心法均可獲得較高純度的細胞系線粒體蛋白質(zhì)。但前一種方法的線粒體獲得率高，可重復(fù)性好。經(jīng)westernblot正反相驗證，基本沒有大量胞膜、胞漿和胞核成分的混雜。 3．運用胍基化修飾的乙?；€(wěn)定同位素標(biāo)記法聯(lián)合液相色譜、質(zhì)譜分析技術(shù)制備卵巢癌細胞系SKOV3和A2780的線粒體蛋白質(zhì)表達譜獲得成功。經(jīng)過比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，兩種細胞細胞系有8個共同