鼻咽癌間質(zhì)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、間質(zhì)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視，現(xiàn)已成為當(dāng)今腫瘤研究的一個(gè)熱門話題。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)南方常見(jiàn)的一種上皮性惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居世界首位，嚴(yán)重危害國(guó)人的生命和健康。 為了從蛋白質(zhì)組水平探討間質(zhì)細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其機(jī)制，本研究采用激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection，LCM)技術(shù)分別從活檢的NPC組織和正常

2、鼻咽粘膜(normalnasopharyngal mucosa，NNM)組織中切割純化NPC間質(zhì)和NNM間質(zhì)，應(yīng)用熒光差異雙向凝膠電泳(Fluorescent two-dimensional difference gelelectrophoresis，2D-DIGE)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分離、鑒定間質(zhì)相關(guān)蛋白。建立了LCM純化的NPC間質(zhì)和NNM間質(zhì)蛋白的熒光差異蛋白表達(dá)圖譜，高通量篩選與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的間質(zhì)蛋白，共得到34個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋

3、白質(zhì)點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定得到20個(gè)差異蛋白。其中在NPC間質(zhì)中高表達(dá)的蛋白有Periostin，S100A9，CapG，PYCARD等，低表達(dá)的蛋白有L-plastin，Rho-GDI-β，B23，hnRNPK等。采用Westem blot驗(yàn)證了其中部分差異蛋白(Periostin，S100A9，CapG，L-plastin)在NPC和NNM組織中的表達(dá)水平，證實(shí)了2D-DIGE結(jié)果的可靠性。為探討NPC間質(zhì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能和臨床病理學(xué)意義

4、，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)部分差異蛋白質(zhì)在存檔石蠟包埋組織(30例正常鼻咽粘膜上皮組織、66例原發(fā)NPC及20例頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC)中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異蛋白質(zhì)表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示：Periostin，S100A9和CapG在NPC組織中的表達(dá)較NNM組織中明顯上調(diào)(p<0.01)，L-plastin在NPC組織中的表達(dá)較NNM組織中明顯下調(diào)(p<0.01)；Periostin和S100A9在頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC中的表

5、達(dá)較原發(fā)NPC明顯上調(diào)(p<0.05)，CapG和L-plastin在頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌中的表達(dá)與原發(fā)鼻咽癌比較無(wú)顯著差異(p>0.05)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：Periostin，S100A9，CapG上調(diào)和L-plastin下調(diào)與NPC組織學(xué)分化及臨床分期相關(guān)(p<0.01)，Periostin和S100A9上調(diào)還與NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(p<0.01)。 為進(jìn)一步探討NPC間質(zhì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能和臨床病理學(xué)意義，本研究選取差

6、異蛋白質(zhì)Periostin為研究對(duì)象，首先采用Western blot檢測(cè)其在不同分化程度或轉(zhuǎn)移潛能的NPC細(xì)胞(CNE1、CNE2、5-8F和6-10B)及NIH3T3成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Periostin在CNE1、CNE2、6-10B和3T3細(xì)胞中不表達(dá)，在5-8F細(xì)胞中弱表達(dá)。隨后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將真核表達(dá)載體pCMV-neo(+)-Periostin及其相應(yīng)空白載體pCMV-neo(+)轉(zhuǎn)染6-10B細(xì)胞(低轉(zhuǎn)移

7、潛能細(xì)胞)，建立穩(wěn)定表達(dá)Periostin的細(xì)胞系，同時(shí)將pCMV-neo(+)- Periostin及其相應(yīng)空白載體pCMV-neo(+)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NIH3T3成纖維細(xì)胞。然后以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染6-10B細(xì)胞及瞬時(shí)轉(zhuǎn)然的NIH3T3細(xì)胞為樣本，觀察6-10B細(xì)胞中Periostin高表達(dá)后的細(xì)胞生物學(xué)特性的改變及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinases，MMPs)活性的影響。研究結(jié)果如下：成功建立了穩(wěn)定表達(dá)Peri

8、ostin的6-10B細(xì)胞系(6-10Bperiostin)和空白載體轉(zhuǎn)染的6-10B細(xì)胞系(6-10Bvector)。生物學(xué)特性分析結(jié)果顯示：(1)與對(duì)照組細(xì)胞比較，6-10Bpenostin細(xì)胞周期進(jìn)程加快，Gl期減少，S期、G2期增加；(2)高表達(dá)Periostin的6-10B細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快；(3)6-10Bperiostin細(xì)胞的平板集落形成數(shù)明顯增多；(4)6-10Bpenostin細(xì)胞的軟瓊脂集落形成率顯著

9、提高；(5)6-10Bperiostin細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯增強(qiáng)；(6)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組細(xì)胞比較，Periostin高表達(dá)的細(xì)胞分泌的MMP-2、MMP-9活性增加。接著用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了αvβs整合素(integrinαvβ5)在NPC和NNM組織、6-10Bpenostinn和6-10Bvector、6-10B細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)integrinαvβ5在NPC組織和6-10Bperiostin細(xì)胞中表達(dá)均較

10、對(duì)照組增強(qiáng)，Spearman相關(guān)性分析顯示integrinαvβ5和Periostin在NPC組織中的表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.682，p=0.000)。結(jié)果提示：Periostin可能是通過(guò)與NPC細(xì)胞膜上integrinαvβ5受體結(jié)合來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，提高M(jìn)MPs的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。 綜上所述，本研究采用LCM結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從NPC間質(zhì)和NNM間質(zhì)中篩選到20個(gè)差異蛋白，并通過(guò)臨床病理標(biāo)本到細(xì)胞模

11、型對(duì)差異蛋白Periostin的功能及作用機(jī)理進(jìn)行了探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示periostin在NPC病程演進(jìn)中發(fā)揮正向調(diào)控作用：Periostin與NPC的分化程度、轉(zhuǎn)移相關(guān)，Periostin高表達(dá)可促進(jìn)NPC的侵襲和轉(zhuǎn)移，Periostin可能通過(guò)與NPC細(xì)胞膜上的integrin-αvβ5受體結(jié)合發(fā)揮其功能。Periostin促進(jìn)NPC轉(zhuǎn)移與其影響MMPs的活性有關(guān)。研究結(jié)果提示：這些差異表達(dá)的蛋白將有助于闡明鼻咽癌細(xì)胞和周圍間質(zhì)的關(guān)