本周氏蛋白導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤腎損傷毒性機(jī)制的體外研究.pdf

1、研究背景
　　 多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是單克隆漿細(xì)胞異常增生的惡性疾病，約占血液系統(tǒng)腫瘤10％。其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，包括貧血，骨骼病變，高鈣血癥，腎功能不全，免疫功能受損等。腎損傷是MM患者常見的合并癥，發(fā)生率約在25％～50％。腎功能損傷對(duì)MM患者的腎預(yù)后有重要意義，研究表明，MM患者中位生存時(shí)間約為3年，而伴有腎損傷的MM患者中位生存時(shí)間僅為0.91年，并且腎功能衰竭是MM患者主要死亡原因之一，僅次

2、于感染。
　　 MM患者腎損傷發(fā)生的機(jī)制是多因素作用的結(jié)果，盡管脫水、感染、高鈣血癥、藥物腎毒性和造影劑等多因素可能導(dǎo)致腎功能損傷，但是主要機(jī)制是由大量分泌的單克隆輕鏈(lightchain,LC)，即本周氏蛋白(bencejonesprotein,BJP)所導(dǎo)致的。BJP可以引起腎臟損傷，形成“骨髓瘤腎(myelomakidney)"，其病理類型包括管型腎病(castnephropathy,CN)、淀粉樣變性（amyloido

3、sis）、單克隆免疫球蛋白沉積病(monoclonalIgdepositiondisease，MIDD)中的輕鏈蛋白沉積病(lightchaindepositiondisease，LCDD)和Fanconi綜合征等。
　　 管型腎病是MM腎損害最主要的因素，約占60％。大量BJP從腎小球?yàn)V過后進(jìn)入腎小管，在遠(yuǎn)端小管中與Tamm-Horsfall蛋白(Tamm-Horsfallglycoprotein,THP)結(jié)合形成BJP管型，

4、大量的BJP管型阻塞腎小管，導(dǎo)致管型腎病的發(fā)生，引起腎功能損害。研究發(fā)現(xiàn)雖然管型形成影響著管型腎病的發(fā)生發(fā)展，但BJP對(duì)腎小管上皮細(xì)胞直接毒性作用在管型腎病中也起著重要作用。Matsuura等人研究還發(fā)現(xiàn)某些BJP在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能夠?qū)δI小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致其凋亡壞死，BJP的這種毒性作用可能是其導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制之一。然而，并不是所有分泌BJP的MM患者都發(fā)生腎損傷，可能與BJP某種特殊的理化性質(zhì)有關(guān)。有學(xué)者研究顯示BJP具有

5、酰胺酶和DNA裂解活性，并證實(shí)BJP對(duì)腎臟的毒性作用與酰胺酶活性關(guān)系更加密切。
　　 淀粉樣變性和輕鏈蛋白沉積病都是由于骨髓瘤細(xì)胞分泌的大量輕鏈蛋白及其片段異常沉積于腎組織引起的腎損害，臨床上常表現(xiàn)為腎病綜合征。輕鏈蛋白的類型在兩者間的發(fā)病率不盡相同，在淀粉樣變性中多見λ型輕鏈，而在單克隆免疫球蛋白沉積病中κ型輕鏈約占70％，說明輕鏈蛋白特殊的結(jié)構(gòu)可引起不同的病理改變。
　　 然而，人們對(duì)BJP的化學(xué)腎毒性仍未徹底了解。

6、BJP水平與MM患者腎損傷并不一致。有的患者BJP高濃度但其腎功能并未發(fā)生損傷，相反有的患者BJP濃度水平較低，但其臨床表現(xiàn)出腎損傷，表明BJP引起腎損害不僅是由分泌量決定的，還有BJP自身催化作用機(jī)制，導(dǎo)致腎損害的發(fā)生。
　　 目的
　　 本研究通過測定MM患者BJP酰胺酶催化作用水解底物后其吸光值的差值，根據(jù)Hanes作圖法求得其催化常數(shù)Km值和催化效率kcat值。將BJP與豬腎小管上皮細(xì)胞(LLC-PK1)共同培養(yǎng)

7、后，通過MTT法以及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞情況，觀察LLC-PK1細(xì)胞的情況來明確BJP催化作用對(duì)腎小管細(xì)胞毒性作用的關(guān)系，明確BJP酰胺酶催化作用對(duì)MM腎損害發(fā)生的毒性機(jī)制。
　　 方法
　　 1BJP的提純
　　 留取BJP陽性尿患者24h尿液，每1000ml加入261g固體硫酸銨，4℃過夜，離心棄上清;用PB液(PH7.0)溶解后透析除鹽，濃縮;過SephadexG-100柱，用PB液(PH7.0)洗脫，收集輕

8、鏈峰，濃縮;用PB液(PH7.0)平衡后過DEAESepharoseCL-6B柱，分管收集;洗脫峰各管用12％SDS-PAGE電泳鑒定后濃縮，分管放入-80℃冰箱保存。
　　 2LLC-PK1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 豬腎小管上皮細(xì)胞LLC-PK1取自Hampshire豬腎組織，貼壁生長，用含血清8％的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)，在37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。
　　 3BJP酰胺酶催化作用的測定
　　 BJ

9、P具有酰胺酶活性，能夠水解胰酶顯色底物中Arg-pNA之間的酰胺鍵，苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基酰替苯胺鹽酸鹽(BANPA)含Arg-pNA鍵，本研究使用BANPA作為底物測定不同濃度下BJP催化反應(yīng)的初始速度，采用米氏方程作圖法得出BJP的Km和kcat值。取150μl37℃預(yù)熱不同濃度(50、100、200、500、1000μmol/L)的BANPA加入50μlBJP（終濃度為5mg/ml），對(duì)照組加入等量pH7.4，0.05mo

10、l/L的Tris緩沖液。37℃反應(yīng)5min后，乙酸終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在405nm測光吸收值A(chǔ)，以空白組調(diào)零，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組吸光值差△A，使用Hanes作圖法求得Km值和kcat值。
　　 4BJP對(duì)LLC-PK1細(xì)胞的抑制作用
　　 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖及增殖抑制率
　　 將LLC-PK1細(xì)胞密度接種于96孔板中，在37℃孵育24h后將M199培養(yǎng)液（無血清）中分別加入BJP(終濃度分別為2.5mg/

11、ml、5mg/ml和10mg/ml)后再次放入37℃培養(yǎng)，對(duì)照組只加入等量的PBS，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后將各孔加入MTT20μl，細(xì)胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸出培養(yǎng)液加入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)震蕩溶解后，使用酶標(biāo)儀測定各孔在570nm的吸光度A，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A平均值/對(duì)照組A平均值）×100％。
　　 5BJP抑制LLC-PK1細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

12、　　 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡壞死
　　 在含8％胎牛血清的M199培養(yǎng)液中常規(guī)傳代培養(yǎng)LLC-PK1細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h貼壁，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，分別加入5、6、8號(hào)患者的BJP共同培養(yǎng)（終濃度分別為2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml），對(duì)照組只加入等量的PBS，設(shè)3個(gè)復(fù)孔;24h后消化收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次。取1～5×105個(gè)細(xì)胞加入500μl結(jié)合液混勻后加入5μlAnnexinV-FIT

13、C和5μlPI溶液，室溫下避光孵育，流式細(xì)胞儀分析。
　　 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)處理均用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量指標(biāo)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。僅對(duì)兩個(gè)獨(dú)立組均數(shù)比較時(shí)用成組t檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)用Satterthwaite校正t檢驗(yàn)。同一組的病人不同濃度的BJP的多組比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的兩因素方差分析;兩組間多重比較方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Tamhane'sT2檢驗(yàn)。P≤0.05為

14、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1MM患者的臨床數(shù)據(jù)
　　 13例MM患者的均按《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)（第3版）》標(biāo)準(zhǔn)診斷明確。按照患者的血清肌酐值(serumcreatinine，Scr)作為分組標(biāo)準(zhǔn)，將Scr≥178μmol/L的患者作為有腎損組(n=5)，Scr＜178μmol/L的患者為無腎損組(n=8)，每組數(shù)據(jù)經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)后可得腎損組患者Scr值顯著高于無腎損組(P=0.044)，而年齡、血

15、尿素氮(BUN)、輕鏈定量、24h蛋白等其他因素兩組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.958，P=0.144，P=0.391，P=0.121).
　　 2提純BJP蛋白及SDS-PAGE電泳鑒定
　　 提取13例MM患者尿中BJP，其中有κ型8例和λ型5例，提純后的BJP通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。免疫球蛋白輕鏈分子量約為25kD，在體內(nèi)κ輕鏈常以單體形式存在;λ輕鏈則常以非共價(jià)結(jié)合形成的二聚體，通過SDS-PAGE電

16、泳，κ型輕鏈可見在分子量25kD處有單一條帶，而λ型輕鏈可見在分子量25kD和50kD處有兩條條帶。
　　 3BJP酰胺酶催化作用的測定
　　 3.1BJPKm值和kcat值
　　 酶的催化作用強(qiáng)弱常由酶動(dòng)力學(xué)指標(biāo)米氏常數(shù)Km值和催化常數(shù)kcat值來反映，Km值反映酶與底物的親和力大小;kcat值反映底物飽和狀態(tài)下酶催化反應(yīng)的速度，kcat越大，表示酶的催化效率越高。采用Hanes作圖法計(jì)算得到結(jié)果顯示各BJP的

17、Km值都在10-4mol/L數(shù)量級(jí)間，不同BJP的kcat值差異較大，而7、10號(hào)患者BJP計(jì)算得出Km值為負(fù)值，無意義。
　　 3.2BJP催化作用最適PH值的測定
　　 由3.1可得出，5、6、8號(hào)BJP的kcat值約是其他BJPkcat值的5～40倍，遂將這三份BJP分別于一系列PH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0)下以BAPNA為反應(yīng)底物測其催化作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BJP在PH為7.0～8.0時(shí)催化作

18、用較強(qiáng)，在PH7.4時(shí)催化作用最強(qiáng)。隨著PH的繼續(xù)降低或升高，BJP的kcat值下降，催化作用減弱。
　　 4BJP對(duì)LLC-PK1的抑制作用
　　 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率
　　 將不同濃度（2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml）BJP與LLC-PK1細(xì)胞共同培養(yǎng)24h用MTT處理后測得組別的不同吸光值，腎損組在三個(gè)濃度下的增殖抑制率分別為:7.4±4.5、13.3±9.4、21.1±13.6;

19、無腎損組在三個(gè)濃度下的增殖抑制率分別為:1.9±3.3、1.3±4.9、1.7±3.9。兩組間相同濃度下吸光值A(chǔ)經(jīng)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎損組BJP在三個(gè)濃度下對(duì)LLC-PK1細(xì)胞增殖抑制率都顯著高于無腎損組(P=0.050，P=0.045，P=0.040)。將13份BJP在2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml濃度下的細(xì)胞增殖抑制率與對(duì)照組經(jīng)t檢驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，5、6、8號(hào)BJP在三個(gè)濃度下引起的細(xì)胞增殖抑制率與對(duì)照組都有顯著差異(P=0.

20、028，P=0.049,P=0.018,P=0.010,P=0.006,P=0.002,P=0.003,P=0.006,P=0.001),而其他10份BJP未產(chǎn)生明顯抑制作用。
　　 5BJP酰胺酶催化作用與其細(xì)胞抑制作用的關(guān)系
　　 在MTT法中，可以觀察到5、6、8號(hào)患者BJP能夠明顯抑制LLC-PK1細(xì)胞增殖，具有明顯的細(xì)胞增殖抑制作用。將5、6、8號(hào)患者BJP在不同濃度下的細(xì)胞增殖抑制率和其kcat值經(jīng)Spear

21、man相關(guān)分析得出BJP的kcat值與BJP在2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml三個(gè)濃度下的細(xì)胞抑制率相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，kcat值與三個(gè)濃度下細(xì)胞抑制率的相關(guān)系數(shù)分別為0.837(P=0.003)、0.872(P=0.002)、0.833(P=0.002)。由此可以得出BJP的kcat越大，細(xì)胞增殖抑制率越高，兩者為正相關(guān)。
　　 6BJP抑制LLC-PK1細(xì)胞增殖的作用機(jī)制
　　 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡壞

22、死
　　 將LLC-PK1細(xì)胞與能夠明顯抑制細(xì)胞增殖的5、6、8號(hào)BJP在不同濃度下共同培養(yǎng)24h后，通過流式細(xì)胞儀檢測得到對(duì)照組、2.5mg/ml組、5mg/ml組和10mg/ml組壞死比例分別為5.1±0.3、9.3±3.0、13.3±2.2和22.0±6.4，凋亡比例分別為0.7±0.1、1.9±0.1、2.7±0.4、5.9±0.7。將同一組的病人不同濃度的BJP導(dǎo)致細(xì)胞的壞死率和凋亡率的多組比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的兩因素

23、方差分析;經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，三組總體方差齊性(P=0.053，P=0.082)，兩組間多重比較方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組相比，5mg/ml和10mg/ml濃度BJP作用的LLC-PK1細(xì)胞壞死顯著增多(P=0.026，P=0.000)，與中低濃度（2.5mg/ml和5mg/ml）相比，高濃度(10mg/ml)BJP誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死的比例顯著增多(P=0.003，P=0.018)。與對(duì)照組相比，2.5mg/ml

24、、5mg/ml和10mg/ml濃度BJP作用的LLC-PK1細(xì)胞凋亡顯著增多(P=0.007，P=0.000，P=0.000)，與中低濃度（2.5mg/ml和5mg/ml）相比，高濃度(10mg/ml)BJP誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死的比例顯著增多(P=0.000，P=0.000)。結(jié)合壞死及凋亡的數(shù)值變化，提示壞死及凋亡占有相當(dāng)比重，且壞死占主要部分。
　　 結(jié)論
　　 1、部分BJP具有酰胺酶活性，且酰胺酶催化作用強(qiáng)弱不同。臨