BMI1基因在喉鱗狀細(xì)胞癌及腫瘤干細(xì)胞中的研究.pdf

1、第一部分人喉鱗狀細(xì)胞癌中BMI1基因的檢測(cè)
　　 目的：探討人喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中BMI1基因的表達(dá)情況及BMI1基因的表達(dá)與喉癌的臨床分期與分型之間的關(guān)系。
　　 方法：收集人喉鱗狀細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)本和癌旁組織，免疫熒光染色法定性檢測(cè)BMI1基因在喉癌標(biāo)本中的表達(dá)情況，Real-time PCR和Western Blot從分子水平和蛋白水平定量比較BMI1基因在喉癌標(biāo)本與正常癌旁組織中的表達(dá)情況，以及BMI1的表達(dá)情況與臨床

2、分期與分型之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：取得20例喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本和20例正常癌旁組織標(biāo)本。其中1-2期喉癌標(biāo)本6例，3-4期標(biāo)本14例；聲門型標(biāo)本4例，聲門上型標(biāo)本16例。腫瘤組織進(jìn)行BMI1基因免疫熒光染色觀察可見BMI1基因普遍表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果顯示BMI1在腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(p<0.01)，其中3-4期腫瘤中的表達(dá)約為1-2期腫瘤中的2倍(p<0.01)，但是聲門型與聲門上型中BMI1表達(dá)的

3、比較不具有顯著差異。Western Blot的結(jié)果也與Real-time PCR的結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：BMI1在喉鱗狀細(xì)胞癌中顯著表達(dá)，其表達(dá)程度與腫瘤的臨床分期有關(guān)，但是與腫瘤的分型無明顯關(guān)系。
　　 第二部分：
　　 目的：將Hep-2細(xì)胞與RNA干擾細(xì)胞進(jìn)行比較，研究BMI1基因?qū)τ谌撕戆〩ep-2細(xì)胞系的作用。
　　 方法：構(gòu)建慢病毒載體，shRNA干擾使喉癌Hep-2細(xì)胞系的BMI1基因表達(dá)

4、下調(diào)。正常培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞和RNAi細(xì)胞于96孔板上，在1、3、5、7天觀察生長狀態(tài)并用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞的增殖狀態(tài)。用有限稀釋法將培養(yǎng)在96孔板中的兩種細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液并培養(yǎng)2周，觀察克隆形成能力并與固定測(cè)量框比較計(jì)算面積比。將Hep-2細(xì)胞與RNAi細(xì)胞培養(yǎng)后用TUNEL和FITC-Annexin V染色，比較細(xì)胞凋亡能力。PI染色后用流式細(xì)胞儀比較兩種細(xì)胞的周期分布情況。兩種細(xì)胞培養(yǎng)后接受劑量為2Gy、4Gy和8Gy的X射

5、線放療，48小時(shí)后以CCK-8法測(cè)吸光度值并計(jì)算抑制率，比較對(duì)放療的耐受性。兩種細(xì)胞中加入3μg/mL，6μg/mL和12μg/mL的順鉑注射液，培養(yǎng)24小時(shí)后以CCK-8法比較對(duì)化療的耐受性。將1×105的Hep-2和RNAi細(xì)胞分別注入10只NOD/SCID小鼠的腋窩皮下，8周后觀察成瘤情況，比較兩組細(xì)胞的致瘤能力。
　　 結(jié)果：shRNA干擾使BMI1表達(dá)下調(diào)，干擾效率為83.75％。Hep-2細(xì)胞和RNAi細(xì)胞培養(yǎng)1周后

6、測(cè)吸光度值，可見從第三天起RNAi細(xì)胞的吸光度明顯低于Hep-2細(xì)胞，并且有停止生長趨勢(shì)。單個(gè)Hep-2和RNAi細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)2周后觀察并用固定測(cè)量框比較面積比，可見RNAi細(xì)胞形成細(xì)胞球體積顯著減小，面積比也降低(p<0.01)。兩組細(xì)胞用TUNEL染色后觀察可見RNAi細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的凋亡能力，F(xiàn)ITC-Annexin V染色后用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果也表明RNAi細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡(p<0.01)。PI染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組

7、細(xì)胞的周期分布，結(jié)果顯示RNAi細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增高，S期和G2/M期的比例都顯著降低。經(jīng)2Gy、4Gy和8Gy的放療后RNAi細(xì)胞對(duì)放療的抑制性顯著增加。經(jīng)3μg/mL，6μg/mL和12μg/mL的順鉑化療后結(jié)果顯示隨著劑量的增加，RNAi細(xì)胞的抑制率在各個(gè)劑量都比Hep-2高。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RNAi組形成的腫瘤體積明顯減小，重量減輕(p<0.01)。
　　 結(jié)論：BMI1沉默能夠抑制Hep-2細(xì)胞的

8、增殖能力，促進(jìn)期凋亡，促使細(xì)胞在G0/G1期聚集，減少對(duì)放化療的耐受性，并且能夠抑制體內(nèi)成瘤能力。
　　 第三部分人喉癌Hep-2細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞中BMI1基因的檢測(cè)
　　 目的：探討B(tài)MI1與CD133在喉癌標(biāo)本中的共同表達(dá)情況以及BMI1在CD133+喉癌干細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 方法：BMI1與CD133在喉癌標(biāo)本中進(jìn)行免疫熒光染色，熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察。流式細(xì)胞儀檢測(cè)喉癌Hep-2細(xì)胞與R

9、NAi細(xì)胞中CD133+細(xì)胞率并進(jìn)行分選。培養(yǎng)觀察分選后的細(xì)胞，Real-time PCR定量檢測(cè)兩組細(xì)胞中CD133的相對(duì)表達(dá)量，以及干細(xì)胞基因Notch2和PTEN的相對(duì)表達(dá)量。
　　 結(jié)果：BMI1和CD133在喉癌標(biāo)本中共同表達(dá)，其中CD133在細(xì)胞膜上表達(dá)，BMI1主要在CD133+細(xì)胞的細(xì)胞核中。Real-time PCR結(jié)果顯示BMI1在CD133+細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于CD133-細(xì)胞(p<0.01)，而Notc

10、h2和PTEN在CD133+和CD133-細(xì)胞中的表達(dá)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：BMI1與CD133在喉鱗狀細(xì)胞癌中共同表達(dá)，并且BMI1主要表達(dá)于CD133+喉癌干細(xì)胞中對(duì)其發(fā)揮作用。Notch2和PTEN對(duì)于CD133+喉癌干細(xì)胞沒有特異性作用。
　　 第四部分：BMI1基因?qū)τ谌撕戆〩ep-2細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞的作用
　　 目的：探討B(tài)MI1基因?qū)τ贑D133+喉癌干細(xì)胞的作用以及對(duì)于相關(guān)基因和信號(hào)通路

11、的影響。
　　 方法：流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep-2細(xì)胞和RNAi細(xì)胞中CD133+喉癌干細(xì)胞的含量并分選。培養(yǎng)分選后的CD133+干細(xì)胞，比較成球能力。Real-time PCR檢測(cè)Hep-2和RNAi細(xì)胞中CD133的相對(duì)表達(dá)量以及BMI1相關(guān)基因p53、p16和cyclinD1的表達(dá)量，分析對(duì)信號(hào)通路的影響。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示RNAi細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的含量明顯比Hep-2細(xì)胞少(p<0.01)。分

12、選后細(xì)胞培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)Hep2-CD133+細(xì)胞的生長速度和成球能力明顯比RNAi-CD133+細(xì)胞強(qiáng)。Real-time PCR結(jié)果顯示RNAi細(xì)胞中CD133的表達(dá)量顯著減少(p<0.01)，同時(shí)在RNAi細(xì)胞中，p53、p16的表達(dá)量顯著增加(p<0.05)，cyclinD1的表達(dá)量顯著減少(p<0.01)。
　　 結(jié)論：BMI1沉默導(dǎo)致了CD133+喉癌干細(xì)胞的減少，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡并且減弱了對(duì)放化療的