BMI1基因在喉鱗狀細胞癌及腫瘤干細胞中的研究.pdf

1、第一部分人喉鱗狀細胞癌中BMI1基因的檢測
　　 目的：探討人喉鱗狀細胞癌標本中BMI1基因的表達情況及BMI1基因的表達與喉癌的臨床分期與分型之間的關系。
　　 方法：收集人喉鱗狀細胞癌腫瘤標本和癌旁組織，免疫熒光染色法定性檢測BMI1基因在喉癌標本中的表達情況，Real-time PCR和Western Blot從分子水平和蛋白水平定量比較BMI1基因在喉癌標本與正常癌旁組織中的表達情況，以及BMI1的表達情況與臨床

2、分期與分型之間的關系。
　　 結果：取得20例喉鱗狀細胞癌標本和20例正常癌旁組織標本。其中1-2期喉癌標本6例，3-4期標本14例；聲門型標本4例，聲門上型標本16例。腫瘤組織進行BMI1基因免疫熒光染色觀察可見BMI1基因普遍表達。Real-time PCR結果顯示BMI1在腫瘤標本中的表達明顯高于癌旁組織(p<0.01)，其中3-4期腫瘤中的表達約為1-2期腫瘤中的2倍(p<0.01)，但是聲門型與聲門上型中BMI1表達的

3、比較不具有顯著差異。Western Blot的結果也與Real-time PCR的結果一致。
　　 結論：BMI1在喉鱗狀細胞癌中顯著表達，其表達程度與腫瘤的臨床分期有關，但是與腫瘤的分型無明顯關系。
　　 第二部分：
　　 目的：將Hep-2細胞與RNA干擾細胞進行比較，研究BMI1基因對于人喉癌Hep-2細胞系的作用。
　　 方法：構建慢病毒載體，shRNA干擾使喉癌Hep-2細胞系的BMI1基因表達

4、下調。正常培養(yǎng)Hep-2細胞和RNAi細胞于96孔板上，在1、3、5、7天觀察生長狀態(tài)并用CCK-8法測定細胞的增殖狀態(tài)。用有限稀釋法將培養(yǎng)在96孔板中的兩種細胞制成單個細胞懸液并培養(yǎng)2周，觀察克隆形成能力并與固定測量框比較計算面積比。將Hep-2細胞與RNAi細胞培養(yǎng)后用TUNEL和FITC-Annexin V染色，比較細胞凋亡能力。PI染色后用流式細胞儀比較兩種細胞的周期分布情況。兩種細胞培養(yǎng)后接受劑量為2Gy、4Gy和8Gy的X射

5、線放療，48小時后以CCK-8法測吸光度值并計算抑制率，比較對放療的耐受性。兩種細胞中加入3μg/mL，6μg/mL和12μg/mL的順鉑注射液，培養(yǎng)24小時后以CCK-8法比較對化療的耐受性。將1×105的Hep-2和RNAi細胞分別注入10只NOD/SCID小鼠的腋窩皮下，8周后觀察成瘤情況，比較兩組細胞的致瘤能力。
　　 結果：shRNA干擾使BMI1表達下調，干擾效率為83.75％。Hep-2細胞和RNAi細胞培養(yǎng)1周后

6、測吸光度值，可見從第三天起RNAi細胞的吸光度明顯低于Hep-2細胞，并且有停止生長趨勢。單個Hep-2和RNAi細胞在96孔板中培養(yǎng)2周后觀察并用固定測量框比較面積比，可見RNAi細胞形成細胞球體積顯著減小，面積比也降低(p<0.01)。兩組細胞用TUNEL染色后觀察可見RNAi細胞呈現較強的凋亡能力，FITC-Annexin V染色后用流式細胞儀分析結果也表明RNAi細胞更容易發(fā)生凋亡(p<0.01)。PI染色后用流式細胞儀檢測兩組

7、細胞的周期分布，結果顯示RNAi細胞處于G0/G1期的細胞比例顯著增高，S期和G2/M期的比例都顯著降低。經2Gy、4Gy和8Gy的放療后RNAi細胞對放療的抑制性顯著增加。經3μg/mL，6μg/mL和12μg/mL的順鉑化療后結果顯示隨著劑量的增加，RNAi細胞的抑制率在各個劑量都比Hep-2高。體內成瘤實驗結果顯示RNAi組形成的腫瘤體積明顯減小，重量減輕(p<0.01)。
　　 結論：BMI1沉默能夠抑制Hep-2細胞的

8、增殖能力，促進期凋亡，促使細胞在G0/G1期聚集，減少對放化療的耐受性，并且能夠抑制體內成瘤能力。
　　 第三部分人喉癌Hep-2細胞系腫瘤干細胞中BMI1基因的檢測
　　 目的：探討B(tài)MI1與CD133在喉癌標本中的共同表達情況以及BMI1在CD133+喉癌干細胞中的表達情況。
　　 方法：BMI1與CD133在喉癌標本中進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察。流式細胞儀檢測喉癌Hep-2細胞與R

9、NAi細胞中CD133+細胞率并進行分選。培養(yǎng)觀察分選后的細胞，Real-time PCR定量檢測兩組細胞中CD133的相對表達量，以及干細胞基因Notch2和PTEN的相對表達量。
　　 結果：BMI1和CD133在喉癌標本中共同表達，其中CD133在細胞膜上表達，BMI1主要在CD133+細胞的細胞核中。Real-time PCR結果顯示BMI1在CD133+細胞中的表達量顯著高于CD133-細胞(p<0.01)，而Notc

10、h2和PTEN在CD133+和CD133-細胞中的表達量沒有統計學差異。
　　 結論：BMI1與CD133在喉鱗狀細胞癌中共同表達，并且BMI1主要表達于CD133+喉癌干細胞中對其發(fā)揮作用。Notch2和PTEN對于CD133+喉癌干細胞沒有特異性作用。
　　 第四部分：BMI1基因對于人喉癌Hep-2細胞系腫瘤干細胞的作用
　　 目的：探討B(tài)MI1基因對于CD133+喉癌干細胞的作用以及對于相關基因和信號通路

11、的影響。
　　 方法：流式細胞儀檢測Hep-2細胞和RNAi細胞中CD133+喉癌干細胞的含量并分選。培養(yǎng)分選后的CD133+干細胞，比較成球能力。Real-time PCR檢測Hep-2和RNAi細胞中CD133的相對表達量以及BMI1相關基因p53、p16和cyclinD1的表達量，分析對信號通路的影響。
　　 結果：流式細胞儀檢測結果顯示RNAi細胞中CD133+細胞的含量明顯比Hep-2細胞少(p<0.01)。分

12、選后細胞培養(yǎng)觀察發(fā)現Hep2-CD133+細胞的生長速度和成球能力明顯比RNAi-CD133+細胞強。Real-time PCR結果顯示RNAi細胞中CD133的表達量顯著減少(p<0.01)，同時在RNAi細胞中，p53、p16的表達量顯著增加(p<0.05)，cyclinD1的表達量顯著減少(p<0.01)。
　　 結論：BMI1沉默導致了CD133+喉癌干細胞的減少，從而抑制了腫瘤細胞的增殖、促進其凋亡并且減弱了對放化療的