松花粉防治腎臟衰老的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 21世紀世界人口老齡化問題越來越嚴重，人類面臨著老齡人口增多的問題，如何養(yǎng)老及延緩衰老等問題嚴峻地擺在我們面前。隨著衰老的發(fā)生，人體的各個器官相繼發(fā)生形態(tài)和功能的退變：細胞數減少，臟器萎縮、變性，組織彈性減低等等，從而導致多種生理功能逐漸減退，引發(fā)一系列的老年性疾病。其中腎臟的衰老和老年腎臟疾病越來越受到人們的重視。
　　 伴隨人口老齡化，慢性腎臟病在世界范圍內呈現流行趨勢，并且醫(yī)療花費巨大。腎臟是人體

2、的重要器官，也是容易衰老的器官，腎臟對維持人體內環(huán)境的穩(wěn)定有著重要作用。中醫(yī)學認為人體的衰老開始于腎，腎為先天之本、生命之根。人體的生長壯老已皆由腎氣決定，腎元盛則壽延，腎元衰則壽夭。因此如能延緩腎臟衰老，則有可能延緩人體的衰老進程。腎臟衰老過程中，臨床表現以腎功能減退最為突出，表現為腎小球濾過率和腎小管的重吸收功能均減退，腎臟的儲備能力下降；衰老腎臟光鏡下觀察具有腎小球硬化、腎小管萎縮或消失、腎血管硬化、結締組織增生等變化。
　

3、　 影響衰老的因素有很多，各種社會因素、經濟、疾病、營養(yǎng)、遺傳、生活習慣、環(huán)境及精神狀態(tài)等都起著一定的作用，是很多因素共同作用的結果，但目前還沒有一種理論能解釋所有的衰老現象。20世紀后期，隨著分子生物學和細胞生物學的研究深入，衰老機理的研究目前已從整體水平、器官水平、細胞水平發(fā)展到分子水平，生物學家們提出了各種學說從不同的角度闡述衰老的機理，如自由基學說、衰老的端區(qū)學說、線粒體DNA突變學說、微量元素學說、交聯學說、生物膜損傷學說、

4、遺傳程序學說、染色體突變學說等等。其中最具有影響力的學說就是自由基學說和線粒體DNA(mtDNA)突變學說。自由基學說主要認為增齡的退行性變化是由自由基的副作用所引起的。自由基性質活潑，極不穩(wěn)定，容易與其它物質反應生成新的自由基，因而往往都有連鎖反應。低濃度適量的自由基為人體生命活動所必需，它可以促進細胞增殖，刺激白細胞和吞噬細胞殺滅細菌，消除炎癥，分解毒物。但自由基含有未配對電子，具有高度反應活性，過量的自由基可引發(fā)鏈式自由基反應、引

5、起不飽和脂肪酸氧化成超氧化物，形成脂褐素引起機體損傷。氧自由基過多還會破壞細胞膜及其他重要成份，使蛋白質和酶變性，當自由基引起的損傷積累戰(zhàn)勝了機體的修復能力，導致細胞分化狀態(tài)的改變、甚至喪失，從而導致和加速機體衰老。線粒體DNA突變學說提出，線粒體具有三羧酸循環(huán)、電子傳遞和氧化磷酸化的作用，線粒體電子傳遞鏈的氧化磷酸化反應為有機體生成約90％的能量(ATP)，因而被稱為細胞的氧化中心和“動力工廠”。線粒體是哺乳動物細胞除細胞核之外唯一含

6、有DNA的細胞器，并擁有自己的遺傳密碼和蛋白質翻譯系統(tǒng)。線粒體DNA呈雙鏈環(huán)狀，人類mtDNA長16569 bp，含37個基因，均為線粒體氧化磷酸化正常功能所必需。mtDNA本身缺乏組蛋白保護及相應的修復系統(tǒng)，易受氧自由基攻擊而誘發(fā)突變，由于mtDNA中各基因排列緊密利用率高，因而mtDNA任何部位的突變都會累及到基因中的一個重要功能區(qū)域，最終導致氧化磷酸化功能受損導致能量產出缺陷、衰老和細胞死亡。
　　 衰老理論的創(chuàng)新為抗衰老

7、藥物的篩選和藥效研究提供了有力的依據。對養(yǎng)生延壽的探索，我國已有3000多年的歷史，對各種具有強身健體和補益作用的藥物的研究資料十分豐富。多年的醫(yī)藥學科研實踐證明，現代醫(yī)學技術和中醫(yī)中藥結合，在延緩衰老藥物的開發(fā)上具有特定優(yōu)勢。
　　 松花粉(pine pollen)藥名松黃，是一種營養(yǎng)價值高，藥理作用廣的中藥保健品，含有松樹植株所具有的一切營養(yǎng)成分和生命活性物質，總量達到200余種。其成分穩(wěn)定、易被機體吸收利用，藥理實驗證明，

8、松花粉中含有大量抗氧化物質，如維生素E、胡蘿卜素及微量元素硒，可以抑制體內脂肪和蛋白質過氧化反應，具有延緩衰老的作用。
　　 目的：
　　 觀察松花粉對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠腎臟的保護作用，并根據衰老的自由基學說、mtDNA突變學說兩方面探討其延緩腎臟衰老作用的機理，從而進一步拓展松花粉的臨床使用范圍，并為開發(fā)研制出抗衰老新藥奠定基礎。
　　 方法
　　 所有小鼠在相同條件下，自由飲水，攝食，保持

9、自然光照，無不良因素影響，飼養(yǎng)一周適應實驗室環(huán)境后開始進行實驗。將30只清潔級、健康雄性昆明小白鼠隨機分為3組：青年對照組、衰老模型組、松花粉治療組，每組10只。本實驗的動物模型為亞急性衰老小鼠模型，所采用的造模方法為：D-半乳糖亞急性衰老模型建立法。實驗開始后，衰老模型組、松花粉治療組小鼠采用每天5％D-半乳糖溶液100 mg/kg頸背部皮下注射，復制亞急性衰老小鼠模型，青年對照組小鼠給予相應的生理鹽水。松花粉治療組小鼠在造模的同時每

10、天給予750mg/kg體重的松花粉灌胃，青年對照組與衰老模型組小鼠則以等體積的生理鹽水灌胃。連續(xù)50d后，采取血清、腎臟組織。觀察各組的腎臟解剖形態(tài)學、組織形態(tài)學改變；檢測各組的血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、腎臟組織超氧化物歧化酶(SOD)活性及其丙二醛(MDA)的含量，并提取各組小鼠腎臟組織中的mtDNA，檢測其mtDNA的相對含量；并采用聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測各組小鼠腎臟組織mtDNA的片段缺失情況。
　　

11、結果
　　 1、與青年對照組相比，衰老模型組小鼠體重增長緩慢、腎臟系數降低(P<0.05)；與衰老模型組相比，松花粉治療組小鼠體重增長顯著加快、腎臟系數提高(P<0.05)； 2、青年對照組小鼠單位視野內腎小球數量較多，呈圓形或橢圓形，外周規(guī)整，腎小囊的囊腔正常，腎小管的管腔規(guī)整；衰老模型組小鼠腎小球分布稀疏，不規(guī)整，腎小球球體相應縮小，腎小囊的囊腔明顯擴大，基底膜增厚，腎小管的管腔擴大，細胞核深染、固縮，系膜增生明顯;松花粉治

12、療組腎小球數量與衰老組相比明顯增多，腎小球萎縮、系膜增生等均較衰老模型組明顯減少，腎小囊囊腔有所減小，基底膜增厚不明顯；3、衰老模型組與青年對照組比較，Scr和BUN水平顯著提高，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；松花粉治療組與衰老模型組比較，BUN和Scr水平顯著下降，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；4、衰老模型組與青年對照組比較，腎組織SOD活性顯著降低，其MDA含量顯著升高，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；松花粉治療組與衰老模型組比較，腎

13、組織SOD活性顯著升高，其MDA含量顯著降低，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；5、衰老模型組與青年對照組比較，腎臟mtDNA相對含量顯著升高，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；松花粉治療組與衰老模型組比較，腎臟mtDNA相對含量顯著降低，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；6、衰老模型組及松花粉治療組小鼠腎臟mtDNA中存在明顯的缺失片段，而在青年對照組小鼠腎臟mtDNA中未檢測到相同片段的缺失，松花粉治療組與衰老模型組比較，小鼠腎臟mtDNA的缺

14、失率顯著降低(t=11.781，P<0.05)。
　　 結論：
　　 1、松花粉能促進衰老小鼠體重的增加，改善其腎臟解剖形態(tài)學的衰老改變。
　　 2、松花粉能夠改善衰老小鼠腎臟組織形態(tài)學衰老改變。
　　 3、松花粉能夠改善衰老小鼠的腎功能。
　　 4、松花粉可減輕衰老腎臟的氧化損傷，其可能是松花粉延緩腎臟的衰老的機制之一。
　　 5、松花粉能夠保護衰老腎臟的mtDNA、可以抑制衰老腎臟mt