松花粉抗下丘腦-垂體-睪丸衰老機(jī)理的研究.pdf

1、衰老是隨著年齡增長，組織細(xì)胞逐漸退化、器官功能下降引起的不可避免的正常生理現(xiàn)象。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，老齡化國家增多，老齡人口的比率加大，人口的老齡化將成為一個社會問題，提高老年人的生活質(zhì)量至關(guān)重要。1977年Basedovsky提出了“免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌”網(wǎng)絡(luò)學(xué)說。1988年Meites提出，在衰老過程中，免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)起著重要調(diào)節(jié)作用，而下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)是其重要組成部分，因而研究抗HPG衰老的藥物迫在眉睫。

2、細(xì)胞衰老過程是借助于信號傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的，其中Rb和p53控制的信號途徑起重要作用。處于兩個衰老誘導(dǎo)途徑核心位置的是抑癌基因產(chǎn)物Rb、p16INK4a、p53、p19ARF及p21WAF1抑癌蛋白。本研究采用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，從形態(tài)、激素、基因和蛋白等多個層面系統(tǒng)研究松花粉預(yù)防和延緩衰老的作用機(jī)理，為篩選抗下丘腦-垂體-性腺軸衰老中藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 一、松花粉對D-半乳糖所致衰老大鼠血清抗氧化能力的影響目的觀察松花粉

3、抗D-半乳糖所致亞急性衰老模型大鼠抗氧化能力的影響。 方法1.模型的建立及分組(1)衰老模型的建立：選用清潔級8周齡雄性SD大鼠120只，體重180～220g(由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供)。按200mg/kg/d腹腔注射D-半乳糖(用生理鹽水配成5％的溶液)，連續(xù)50d。 (2)實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蠓纸M情況如下，正常對照組(10只)；松花粉預(yù)防組(中、低劑量組各13只)；將造模成功的大鼠分為模型組(14只

4、)、松花粉延緩衰老組(高、中、低劑量組各14只)、自然恢復(fù)組(14只)、VE陽性對照組(14只)。 2.各實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)內(nèi)眥取血2ml，離心取上清，分別用生物化學(xué)方法檢測血清SOD、GSH-PX和T-AOC活力以及MDA的含量。 結(jié)果大鼠血清抗氧化能力的改變：D-半乳糖所致亞急性衰老模型大鼠SOD活力、GSH-PX活力和T-AOC均明顯下降，MDA含量明顯上升，與正常對照組比較差異顯著(P＜0.01)，自然恢復(fù)組與模型組比

5、較無明顯差別(P＞0.05)，而松花粉給藥組SOD活力、GSH-PX活力和T-AOC三者均顯著提高，MDA含量明顯下降，其中松花粉中劑量組效果最好。 結(jié)論松花粉可顯著提高D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠血清SOD、GSH-PX抗氧化酶活性，從而提高總抗氧化能力，減少血清MDA的堆積。 二、松花粉抗下丘腦、垂體衰老作用的研究目的1.通過檢測各組大鼠下丘腦內(nèi)GnRH、SP、β-EP的含量，分析松花粉預(yù)防和延緩下丘腦衰老的作用機(jī)制

6、。 2.通過檢測各組大鼠血清LH、FSH、IGF-Ⅰ含量的變化，探討松花粉抗垂體衰老的作用。 方法1.用放射免疫法檢測各組大鼠血清LH、FSH；用酶聯(lián)免疫法檢測IGF-Ⅰ的含量。 2.大鼠斷頭取下丘腦，采用放射免疫法檢測各組大鼠SP、β-EP和GnRH的含量。 結(jié)果1.下丘腦GnRH、SP和β-EP的變化：模型組下丘腦GnRH、SP明顯增高，β-EP明顯降低，與正常組相比有顯著差異(P＜0.01)；模型組

7、與自然恢復(fù)組之間比較差異無顯著性(P＞0.05)；松花粉能夠明顯提高β-EP的含量，降低GnRH、SP的濃度，松花粉中劑量組明顯好于其它各組(P＜0.01)。 2.血清促性腺激素和IGF-Ⅰ含量：模型組血清LH、FSH含量明顯升高，IGF-Ⅰ含量明顯下降，與正常組比較差異有顯著性(P＜0.01)；與自然恢復(fù)組比較差異無顯著性(P＞0.05)；松花粉能顯著降低衰老大鼠血清LH、FSH含量，提高IGF-Ⅰ濃度(P＜0.01)；其中預(yù)

8、防中劑量組效果最為明顯，松花粉組好于VE對照組。 結(jié)論松花粉上調(diào)下丘腦β-EP的含量，下調(diào)GnRH、SP的濃度，降低血清LH、FSH含量，提高IGF-1濃度。因此表明松花粉預(yù)防和延緩下丘腦、垂體衰老的作用。 三、探討松花粉預(yù)防和延緩睪丸組織衰老的作用目的通過免疫組織化學(xué)、原位雜交和放射免疫方法觀察松花粉預(yù)防和延緩睪丸組織的衰老作用。 方法1.通過免疫組織化學(xué)方法觀察各組大鼠睪丸細(xì)胞LHR、EGFR的表達(dá)。2.原位

9、雜交方法檢測各組大鼠睪丸細(xì)胞IGF-ⅠmRNA的變化情況。3.放射免疫法檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清睪酮含量的變化。4.觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠精子數(shù)量、活動度和存活率的變化。 結(jié)果1.血清睪酮含量：模型組血清T含量明顯降低，與正常組比較有顯著差異(P＜0.01)；與自然恢復(fù)組和高劑量延緩衰老組相比無顯著差異(P＞0.05)；松花粉預(yù)防和延緩衰老中、低劑量組能夠顯著提高血清T的含量(P＜0.01)，其作用強(qiáng)于VE對照組。 2.EGFR：

10、在睪丸組織廣泛表達(dá)，陽性產(chǎn)物主要分布在睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的胞漿，呈棕黃色顆?；驁F(tuán)塊狀。模型組EGFR表達(dá)量明顯減少，與正常對照組比較有顯著性(P＜0.01)；與自然恢復(fù)組和高劑量延緩衰老組比較無顯著差異(P＞0.05)；而松花粉預(yù)防和延緩衰老中、低劑量組均能明顯提高EGFR的表達(dá)，強(qiáng)于VE陽性對照組。 3.IGF-Ⅰ基因表達(dá)：IGF-ⅠmRNA陽性細(xì)胞主要為睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和肌樣細(xì)胞。陽性產(chǎn)物位于胞

11、漿呈彌散的顆粒狀。模型組IGF-ⅠmRNA的表達(dá)明顯減少，與正常組比較有顯著差異(P＜0.01)；與自然恢復(fù)組和高劑量延緩衰老組比較無顯著差異(P＞0.05)；松花粉中、低劑量組能夠顯著提高IGF-ⅠmRNA的表達(dá)，其作用明顯強(qiáng)于VE陽性對照組。 4.LHR：在睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞均有表達(dá)，免疫陽性產(chǎn)物分布在細(xì)胞漿，呈棕黃色的顆粒或團(tuán)塊狀。模型組睪丸間質(zhì)細(xì)胞LHR的表達(dá)與正常組相比明顯降低(P＜0.01)；模型組與自

12、然恢復(fù)組和高劑量延緩衰老組之間無明顯差異(P＞0.05)；松花粉預(yù)防和延緩衰老中、低劑量組均能明顯提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞LHR的表達(dá)，效果明顯強(qiáng)于VE對照組。而模型組睪丸精母細(xì)胞、精子細(xì)胞LHR的表達(dá)比正常組明顯升高(P＜0.01)，模型組與自然恢復(fù)組、高劑量延緩衰老組無差異；松花粉預(yù)防和延緩衰老中、低劑量組明顯降低生精細(xì)胞LHR的表達(dá)。 5.精子的活動度、存活率和精子數(shù)量的變化：模型組精子的活動度、存活率和精子的數(shù)量均比正常對照組顯

13、著降低；松花粉預(yù)防組和延緩衰老組的中、低劑量組可明顯提高精子的活動度及存活率(P＜0.01)，并能提高精子的數(shù)量(P＜0.05)，與模型組比較均有顯著性差異；VE陽性對照組能夠提高精子的存活率和精子的數(shù)量，與模型組比較有顯著差異，但對精子的活動度影響不明顯；松花粉高劑量延緩衰老組精子的數(shù)量有所提高，但與模型組比較無明顯差異，松花粉高劑量可以提高精子的存活率(P＜0.01)，但抑制精子活動度(P＜0.05)。 結(jié)論我們的研究結(jié)果表

14、明，松花粉能夠改變睪丸細(xì)胞EGFR、LHR、IGF-Ⅰ的表達(dá)以及血清T的含量，顯著提高精子的活動度、存活率和精子的數(shù)量，從而改善睪丸生精功能。 四、睪丸細(xì)胞衰老通路的研究及松花粉的影響目的通過檢測p53基因及相關(guān)蛋白p16、p19、p21在睪丸組織的表達(dá)，探討睪丸細(xì)胞衰老途徑及松花粉的影響。 方法(1)采用RT-PCR方法檢測p53基因的表達(dá)。(2)WesternBlotting檢測大鼠睪丸p16、p19、p21蛋白表達(dá)

15、量的變化。 結(jié)果1.p53基因的表達(dá)：模型組p53基因表達(dá)明顯高于正常對照組，與自然恢復(fù)組無差異；松花粉預(yù)防組和延緩衰老組p53基因的表達(dá)明顯降低。 2.p16、p19、p21蛋白含量的變化：模型組睪丸細(xì)胞p16、p19、p21蛋白的表達(dá)明顯升高，松花粉預(yù)防和延緩衰老組睪丸細(xì)胞p16、p19、p21蛋白的含量明顯下調(diào)。 結(jié)論睪丸細(xì)胞通過激活Rb/p16和p53/p19/p21兩條途徑而衰老；松花粉通過降低p53、