肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及其生物學(xué)特性.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及其生物學(xué)特性姓名：左國(guó)華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（普外）指導(dǎo)教師：梁平20080501第三軍醫(yī)人學(xué)博十學(xué)何論文后，將微量肝癌HepG2細(xì)胞與外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液混勻，再通過(guò)免疫磁性細(xì)胞分離，行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，檢測(cè)免疫磁珠的特異性和敏感性，并計(jì)算癌細(xì)胞的回收率。(2)采集肝癌患者56例、肝炎和肝硬化患者19例、繼發(fā)性肝癌患者11例血樣，及18個(gè)健康志愿者的血樣作為陰性對(duì)照

2、。用Ficoll密度梯度離心與免疫磁珠技術(shù)首先對(duì)患者的外周血進(jìn)行癌細(xì)胞的富集，然后運(yùn)用FITC—CK標(biāo)記富集的癌細(xì)胞，免疫細(xì)胞熒光技術(shù)對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞行形態(tài)學(xué)分析，并用巢式RT—PCR技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)AFPmRNA和hTERTmRNA。(3)對(duì)8例富集分離出來(lái)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞倍增時(shí)間評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力，錨著獨(dú)立性試驗(yàn)了解克隆集落能力，掃描電鏡觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)，以及裸鼠移植及成瘤觀察等方法研究其細(xì)胞生物學(xué)特性

3、。結(jié)果：(1)包被HAbl8的免疫磁珠能與HepG2細(xì)胞敏感而特異地結(jié)合，當(dāng)單個(gè)核細(xì)胞與HepG2細(xì)胞比為1106：l時(shí)可檢測(cè)到癌細(xì)胞，結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)方法可檢出外周血單個(gè)核細(xì)胞中572％的微量癌細(xì)胞，無(wú)假陽(yáng)性。(2)在用肝癌HepG2細(xì)胞所做的2組預(yù)實(shí)驗(yàn)中，免疫磁珠聯(lián)用增強(qiáng)了巢式RT—PCR的靈敏度、特異性，其靈敏度為5ml血中含有一個(gè)癌細(xì)胞。(3)在臨床樣品的實(shí)驗(yàn)中，免疫磁珠富集后，結(jié)合免疫細(xì)胞熒光方法觀察肝癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)

4、胞，檢出陽(yáng)性率為429％(24／56)，并與腫瘤的TNM分期有關(guān)；檢出細(xì)胞的形態(tài)可分為四類：中等細(xì)胞型、大細(xì)胞型、有核細(xì)胞碎片和無(wú)核細(xì)胞碎片。(4)肝癌患者外周血中AFPmRNA及hTERTmRNA的檢出陽(yáng)性率分別為554％、482％。AFPmRNA及hTERTmRNA的檢出率和TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移臨床參數(shù)密切相關(guān)。當(dāng)肝癌直徑大于5cm、多結(jié)節(jié)、伴門(mén)靜脈癌栓，AFPmRNA及hTERTmRNA的檢出率均明顯提高(PO05)。679％的肝

5、癌患者至少表達(dá)一種標(biāo)志物，357％的患者兩種標(biāo)志物均陽(yáng)性。AFPmRNA和hTERTmRNA的檢出呈『F相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0363(P005)。hTERTmRNA在AFPmRNA陽(yáng)性和陰性的肝癌患者檢出率分別為645％、28％(P005)。AFPmRNA在肝炎和肝硬化患者中檢出率為211％(HCCvs肝炎和肝硬化，PO05)，繼發(fā)性肝癌患者及健康成人均未檢出；hTERTmRNA在繼發(fā)性肝癌患者中檢出率為636％，而肝炎和肝硬化及健康成人中