來(lái)源于肝癌門靜脈癌栓的肝癌細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的: 建立來(lái)源于門靜脈癌栓的肝癌細(xì)胞系，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析，為研究門靜脈癌栓形成機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)材料。 方法: 第一部分：來(lái)源于門靜脈癌栓的人肝癌細(xì)胞系CSQT-1的建立 膠原酶消化法對(duì)活體人肝癌標(biāo)本及門靜脈癌栓標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)；采用挑取克隆細(xì)胞島擴(kuò)大培養(yǎng)、自然純化法行單一肝癌細(xì)胞純化；光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；胰蛋白酶法消化傳代培養(yǎng)細(xì)胞；采用慢凍和快融進(jìn)行細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇。 第二部分：人肝

2、癌細(xì)胞系CSQT-1的生物學(xué)特性鑒定 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察采用光鏡觀察；超微結(jié)構(gòu)用電鏡觀察；胎盤藍(lán)染色計(jì)數(shù)檢測(cè)凍存后復(fù)蘇存活率；細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定貼壁率；MTT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)期曲線；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和DNA組成；常規(guī)制備染色體標(biāo)本，拍照分析核型；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成率；裸鼠皮下接種CSQT-1細(xì)胞懸液，接種后觀察成瘤情況，計(jì)算異種移植率；透射電子顯微鏡鑒定細(xì)胞系的污染情況。 第三部分：構(gòu)建人肝癌門靜脈癌栓裸鼠模型及細(xì)胞

3、系CSQT-2的建立和特點(diǎn)分析 將人肝癌門靜脈癌栓新鮮組織接種到裸鼠肝臟包膜下，形成移植瘤，然后利用移植瘤過(guò)繼傳代到裸鼠肝臟，經(jīng)過(guò)5次傳代后，移植瘤生長(zhǎng)比較穩(wěn)定。取裸鼠移植瘤，采用膠原酶消化法以及挑取克隆細(xì)胞島擴(kuò)大培養(yǎng)、自然純化法行單一肝癌細(xì)胞純化新建細(xì)胞系。對(duì)該新建細(xì)胞系進(jìn)行生物學(xué)特性分析，將裸鼠成瘤的肝臟用石蠟包埋后制成標(biāo)本，并使用HE染色后觀察有無(wú)裸鼠門靜脈鏡下微癌栓的出現(xiàn)。 結(jié)果: 第一部分：細(xì)胞原代培養(yǎng)

4、早期，生長(zhǎng)比較不穩(wěn)定，10代以前細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)需要較高的接種密度，而且細(xì)胞倍增時(shí)間不同。到第15代時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)已比較穩(wěn)定。細(xì)胞呈上皮樣，大小不一，以多角形、多邊形為主，占90％以上。細(xì)胞在高密度時(shí)(＞2×106/mL)可見重疊及堆積生長(zhǎng)。傳代時(shí)間一般為2-3天。 第二部分：CSQT-1細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定 利用人肝癌門靜脈癌栓新鮮組織塊進(jìn)行原代培養(yǎng)起來(lái)的細(xì)胞系CSQT-1，掃描電鏡顯示細(xì)胞表面豐富微絨毛，細(xì)胞大小不等，直徑在

5、10-20um之間，透射電鏡下見細(xì)胞以不規(guī)則型為主，細(xì)胞間有橋粒緊密連接等，有少量連接復(fù)合；細(xì)胞間有形成腺結(jié)構(gòu)及條索結(jié)構(gòu)傾向，可形成類似膽小管結(jié)構(gòu)；細(xì)胞質(zhì)豐富，有大量糖原顆粒形成糖原湖樣結(jié)構(gòu)；線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較發(fā)達(dá)，有豐富的游離核糖體；細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，有重疊現(xiàn)象細(xì)胞失去接觸抑制生長(zhǎng)核質(zhì)比例倒置等。凍存后復(fù)蘇成活率為95％。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示上皮樣惡性腫瘤生長(zhǎng)特性，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為48h，4h后貼壁率已超過(guò)90％，細(xì)胞軟瓊脂中生長(zhǎng)，克隆

6、形成率為20％。DNA周期分析：G0/G1為64％，G2/M為19％，S為10％。染色體眾數(shù)以亞四倍體為主。細(xì)胞培養(yǎng)上清液AFP陰性，HBsAg陰性。CSQT-1細(xì)胞能在裸鼠中的成瘤。透射電鏡檢CSQT-1細(xì)胞無(wú)支原體污染。 第三部分：通過(guò)裸鼠皮下移植瘤及外科原位接種的方法建立了人肝癌門靜脈癌栓裸鼠皮下移植瘤模型和人肝癌門靜脈癌栓原位移植模型，并且在該肝臟腫瘤組織中成功培養(yǎng)出CSQT-2細(xì)胞系。通過(guò)對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行核型分析及光電鏡

7、分析顯示其起源于人肝癌門靜脈癌栓組織，并且從其成瘤的肝臟中找到了鏡下門靜脈微癌栓的證據(jù)。 結(jié)論: 1.由人肝癌門靜脈癌栓組織培養(yǎng)的CSQT-1細(xì)胞系和通過(guò)裸鼠原位移植瘤培養(yǎng)的CSQT-2細(xì)胞系均能穩(wěn)定生長(zhǎng)，具有無(wú)限生長(zhǎng)的能力。該細(xì)胞系保持了來(lái)源組織的一些特性，AFP和HBsAg陰性，細(xì)胞間有形成腺結(jié)構(gòu)及條索結(jié)構(gòu)傾向。 2.來(lái)源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細(xì)胞系和其他人肝癌細(xì)胞系相比，有其不同的生物學(xué)特性，主要表現(xiàn)為：

8、①直接來(lái)源于人肝癌門靜脈癌栓組織或者裸鼠原位移植瘤；②生長(zhǎng)較迅速，貼壁快，細(xì)胞倍增時(shí)間分別為48h和36h；③AFP陰性，而大多數(shù)人癌細(xì)胞系的AFP為陽(yáng)性。④一定數(shù)量的細(xì)胞種植于裸鼠后能形成腫瘤，且腫瘤隨著時(shí)間生長(zhǎng)迅速；⑤生物學(xué)特性穩(wěn)定，對(duì)不同代細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、腫瘤標(biāo)記物和與肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物CD133陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果，未顯示有明顯變化。⑥來(lái)源于人門靜脈癌栓的細(xì)胞系也具有在裸鼠形成門靜脈癌栓的能力。因此，CSQT-1及CSQT-2是兩株新建