妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者蛻膜及外周血中NK細(xì)胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、研究背景：妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)是妊娠晚期特有的并發(fā)癥，以全身皮膚瘙癢、肝功能異常、伴有不同程度的黃疸為特征，其主要危及胎兒，易引起早產(chǎn)、胎兒窘迫、死胎、死產(chǎn)等。目前對(duì)于ICP確切的發(fā)病原因，以及宮內(nèi)缺氧的機(jī)制尚未完全明確，迫切需要明確闡述ICP的發(fā)病原因，才有可能建立有效的預(yù)防、治療措施。 已有研究表明該病的發(fā)生與妊娠期母體免疫功能紊亂有關(guān)。近年來國(guó)內(nèi)外提出了母胎界面這一概念，其核心內(nèi)容是母胎界面由母體的子宮蛻膜和胎兒

2、滋養(yǎng)層共同構(gòu)成，母胎界面內(nèi)的多種細(xì)胞成份及其分泌的細(xì)胞因子構(gòu)成了特殊的母胎界面免疫微環(huán)境，在保護(hù)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育、免受母體的免疫排斥中起重要作用。在人類妊娠過程(尤其早期妊娠)中，NK細(xì)胞是蛻膜中最豐富的淋巴細(xì)胞，它與胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞直接接觸，是唯一粘附于滋養(yǎng)層細(xì)胞表面的子宮淋巴細(xì)胞。dNK細(xì)胞主要分布于母體與胚胎接觸的蛻膜，是母體直接識(shí)別胎兒抗原的免疫細(xì)胞，它的獨(dú)特的表型及功能不但能維持母胎界面的免疫耐受，還能分泌一系列細(xì)胞因子促進(jìn)蛻膜血管

3、重建及Th1/Th2平衡網(wǎng)絡(luò)的維持。若dNK細(xì)胞的數(shù)量及功能失調(diào)則可能誘發(fā)病理妊娠。 本課題研究ICP患者蛻膜及外周血中NK細(xì)胞的含量、表型、功能狀態(tài)的變化，研究ICP患者蛻膜及外周血中NK細(xì)胞的Th1、Th2型細(xì)胞因子的分泌情況是否同時(shí)出現(xiàn)在局部免疫與系統(tǒng)免疫，為進(jìn)一步研究母胎免疫耐受的形成機(jī)制、ICP患者母胎界面免疫微環(huán)境變化的細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)機(jī)制提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。探討ICP患者全身系統(tǒng)與母胎界面局部免疫微環(huán)境變化的關(guān)系

4、，無疑為ICP的發(fā)病機(jī)制提供新的解釋。 目的： 檢測(cè)ICP患者蛻膜及外周血中NK細(xì)胞的含量、表型、Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)、殺傷功能方面的變化，探討ICP患者蛻膜及外周血中NK細(xì)胞獨(dú)特的表型、功能及其與滋養(yǎng)細(xì)胞的相互識(shí)別關(guān)系在系統(tǒng)免疫與母胎界面免疫耐受之間的重要聯(lián)系。 方法： 1)收取重度ICP患者(實(shí)驗(yàn)組，15例)和正常晚孕(對(duì)照組，15例)壁蛻膜組織及同一人外周血，機(jī)械研磨法聯(lián)合密度梯度離心法分離

5、出蛻膜單個(gè)核細(xì)胞，單純密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛻膜及外周血中NK細(xì)胞的含量及表型。 2)收集重度ICP患者和正常晚孕胎盤組織各6例，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩組胎盤滋養(yǎng)層中NKG2A的配體HLA-G，HLA-E和NKG2D的配體MICA mRNA的表達(dá)情況。 3)ELISA法檢測(cè)ICP組和正常晚孕組壁蛻膜及外周血單個(gè)核細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-4的表達(dá) 4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ICP組和正常晚

6、孕組壁蛻膜及外周血中NK細(xì)胞內(nèi)Th1/Th2型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的表達(dá)。 5)LDH法分別測(cè)定蛻膜及外周血中單個(gè)核細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞敏感性靶細(xì)胞K562的殺傷活性。 結(jié)果： 1)外周血中的NK細(xì)胞是以CD56+CDl6+為主，蛻膜中的NK細(xì)胞是以CD56+CDl6-為主。ICP組外周血中的NK細(xì)胞含量明顯高于對(duì)照組外周血中的NK細(xì)胞含量(P<0.05)，ICP組蛻膜中NK細(xì)胞含量明顯高于對(duì)照組蛻膜中的NK細(xì)

7、胞含量(P<0.05)。ICP組外周血中CD3-CD56+細(xì)胞、CD56+CDl6-細(xì)胞、CD56+CDl6+細(xì)胞、CD56+NKG2D+細(xì)胞含量均顯著升高(P<0.05)，而CD56+NKG2A+細(xì)胞細(xì)胞含量無顯著變化(P>0.05)。ICP組蛻膜中CD3-CD56+細(xì)胞、CD56+CDl6-細(xì)胞、CD56+CDl6+細(xì)胞、CD56+NKG2D+細(xì)胞含量均顯著升高(P<0.05)，而CD56+NKG2A+細(xì)胞含量無顯著變化(P>0.0

8、5)。 2)與對(duì)照組相比，ICP組蛻膜NK細(xì)胞高表達(dá)NKG2受體家族NKG2A和NKG2D，但在兩組滋養(yǎng)層中檢測(cè)到NKG2A的配體HLA-G和H1A-E，而未檢測(cè)到NKG2D的配體MICA，而且沒有差別。 3)與對(duì)照組相比，ICP患者外周血及蛻膜單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中INF-γ含量均顯著增高(P<0.05)，而IL-4含量無顯著變化(P>0.05)。 4)與對(duì)照組相比，ICP患者dNK及pNK細(xì)胞內(nèi)Th1/Th2型

9、細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的表達(dá)均明顯增高(P<0.05)。 5)在一定效靶比情況下，ICP組蛻膜及外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞敏感性靶細(xì)胞K562的殺傷活性明顯高于對(duì)照組蛻膜及外周血單個(gè)核細(xì)胞。 結(jié)論： ICP組外周血及蛻膜組織中NK細(xì)胞在含量、表型、Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)及殺傷功能方面均與正常晚孕對(duì)照組存在差異，并與滋養(yǎng)層細(xì)胞之間有密切聯(lián)系。異常的免疫應(yīng)答不僅出現(xiàn)在ICP患者的全身系統(tǒng)，而且突出表現(xiàn)在母胎