高山被孢霉maSPT23基因的克隆及功能研究.pdf

1、多不飽和脂肪酸在食品、醫(yī)藥、保健品等領域具有重要作用，它是在一系列酶的作用下由脂酰鏈通過脫氫和延長形成的。因此脂肪酸脫氫酶在脂肪酸代謝以及維持細胞膜正常結構和功能方面有重要作用。隨著越來越多的脂肪酸脫氫酶基因被克隆，該家族的酶促反應和相關的代謝途徑也越來越清楚，人們開始關注調(diào)控脂肪酸脫氫酶基因表達的分子機制。高山被孢霉(Mortierellaalpina)ATCC16266能夠產(chǎn)生多種不飽和脂肪酸，是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株，由于不飽和脂肪酸

2、脫氫酶基因受多種蛋白因子的調(diào)控，所以為了更好地開發(fā)利用此菌，有必要對其調(diào)控因子進行系統(tǒng)地研究。
　　為研究Mortierella alpina中調(diào)控多不飽和脂肪酸的合成基因的調(diào)控因子，對高山被孢霉全基因組序列進行tBlastn搜索，找出并克隆了與釀酒酵母、白假絲酵母等Mga2p/Spt23p蛋白家族同源的、潛在的調(diào)控蛋白基因序列（以下簡稱為maSPT23基因）。為了驗證所獲得基因maSPT23的功能，以釀酒酵母INVScl為出發(fā)菌

3、株，利用同源重組的方法構建釀酒酵母spt23△mga2△雙基因缺失菌株。以此菌株作為maSPT23基因功能驗證的受體菌，構建表達質粒pYES-maSPT23，轉入釀酒酵母spt23△mga2△中，進行異源表達。通過涂布平板實驗表明，maSPT23基因可以在釀酒酵母spt23△mga2△菌中表達，并且可以使缺失株在不加油酸的平板上恢復生長，表明克隆得到的新基因可以補救釀酒酵母Mga2p/Spt23p的功能，激活△9-脂肪酸脫氫酶的表達。<

4、br>　　為了進一步在釀酒酵母中驗證maSPT23基因的功能，以及其對不飽和脂肪酸脫氫酶基因達表的影響，我們從以下幾個方面進行了探索:
　　1、表型的分析:當缺失菌株回補maSPT23基因后，菌株的大小、形態(tài)、質地、顏色、氣味等特征均與野生型菌株相似。從而說明maSpt23p蛋白可以回補釀酒酵母Mga2p/Spt23p的功能，調(diào)節(jié)細胞的生長發(fā)育。
　　2、生長曲線的測定:與缺失菌株相比，當回補異源maSPT23基因后，回補菌

5、株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中可以恢復正常生長。
　　3、不同生長條件對菌株生長的影響:測定回補菌株在乙醇、低溫等不同外界條件下的生長變化，通過生長曲線結果分析，外源回補菌株相對于缺失菌株可以更好的耐受外界環(huán)境刺激。
　　4、氣相色譜分析酵母脂肪酸含量，GC分析結果表明，與缺失菌株相比，回補外源maSPT23基因后，回補菌株胞內(nèi)不飽和脂肪酸含量升高。
　　本研究首次克隆了高山被孢霉maSPT23基因，并對其功能進行了初步