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文檔簡介
1、粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea,異名:粉紅粘帚霉,Gliocladium roseum)是一類重要的菌寄生菌,能夠侵染核盤菌、絲核菌、鐮刀菌和灰葡萄孢等多種植物病原真菌,具有巨大的生防潛力,但目前對(duì)粉紅螺旋聚孢霉生防相關(guān)基因的研究還比較少。本研究從實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的高效菌株67-1寄生核盤菌轉(zhuǎn)錄組中選取差異表達(dá)基因,進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。對(duì)篩選出的轉(zhuǎn)醛醇酶基因Tal67、單加氧酶基因Mon67和α-半乳糖苷酶基因A
2、ga67進(jìn)行生物信息學(xué)分析,通過基因敲除和回補(bǔ)研究其功能。
根據(jù)67-1寄生轉(zhuǎn)錄組分析,選取17個(gè)差異表達(dá)基因,以延伸因子EF1為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明,各基因表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。在菌核誘導(dǎo)過程中(0-48 h),Unigene4498和Unigene8262表達(dá)量升高,在24 h達(dá)到最大值,分別為沒有菌核處理的13.9倍和32.3倍。Unigene13246在前期表達(dá)量有所降低,但48 h時(shí),
3、表達(dá)量顯著提高,是對(duì)照的7.4倍,表明這三個(gè)基因可能參與了粉紅螺旋聚孢霉菌寄生過程。
從67-1全基因組獲得Unigene4498、Unigene8262和Unigene13246基因全長。生物信息學(xué)分析表明,Unigene4498的開放閱讀框(ORF)為750 bp,編碼249 AA,與膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的轉(zhuǎn)醛醇酶同源性為77%,命名為Tal67。Unigene8262
4、的ORF為1266 bp,編碼421 AA,與蝗綠僵菌Metarhizium acridum的單加氧酶同源性為49%,命名為Mon67。Unigene13246的ORF為1668 bp,編碼555 AA,與間座殼屬Diaporthe ampelina的α-半乳糖苷酶的同源性52%,命名為Aga67。
利用同源重組原理構(gòu)建了Tal67、Mon67和Aga67的敲除載體,通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法,分別獲得2株 Tal67
5、敲除突變株ΔTal67-1和ΔTal67-8、3株 Mon67敲除突變株ΔMon67-22、ΔMon67-26和ΔMon67-28,以及2株Aga67敲除突變株ΔAga67-30和ΔAga67-62。根據(jù)Tal67基因全長序列,構(gòu)建了Tal67回補(bǔ)載體,并成功得到5株ΔTal67-8的回補(bǔ)菌株。
對(duì)67-1轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生物學(xué)特性分析,結(jié)果表明,敲除突變株ΔTal67的生長速率顯著低于野生菌株(WT,P<0.05),對(duì)番茄灰霉病菌
6、的拮抗能力和對(duì)核盤菌菌核的寄生能力比WT分別降低了15.8%和24.6%。溫室試驗(yàn)表明,67-1對(duì)大豆菌核病和黃瓜枯萎病的防效分別為65.3%和75.6%,而ΔTal67僅為17.8%和23.1%;回補(bǔ)菌株?Tal67+的防效與WT一致。ΔMon67和ΔAga67的生長速率、產(chǎn)孢水平,以及對(duì)番茄灰霉病菌的拮抗能力與WT沒有顯著差異,但是對(duì)菌核的寄生能力分別降低了34.2%和28.7%,對(duì)黃瓜枯萎病的防效比WT分別降低了51.5%和41.
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