酶膜反應(yīng)器與離交法耦聯(lián)制備酪蛋白磷酸肽.pdf

1、應(yīng)用酶膜反應(yīng)器制備生物活性肽是近年來食品行業(yè)的重要研究領(lǐng)域，它集酶解、分離、純化和酶的回收利用于一體，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)化操作，有利于降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。本文應(yīng)用酶膜反應(yīng)器(EMR)與離交色譜耦聯(lián)連續(xù)分離制備酪蛋白磷酸肽(CPP)。
　　 首先，研究建立酶膜反應(yīng)器與離交色譜耦聯(lián)連續(xù)分離純化酪蛋白CPP工藝。選用堿性蛋白酶Alcalase(?)FG2.4L在切向流酶膜反應(yīng)器中(膜截留分子量10kDa)連續(xù)酶解酪蛋白制備酪

2、蛋白生物活性肽，酶解溫度50℃，pH值8.5，時(shí)間3h，再采用樹脂層析將酪蛋白生物活性肽中的CPP與酪蛋白非磷酸肽(CNPP)分離。通過靜態(tài)吸附解析實(shí)驗(yàn)確定了適合分離純化CPP的樹脂型號(hào)，并采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了CPP動(dòng)態(tài)分離工藝參數(shù)。確定了最佳分離樹脂型號(hào)為大孔弱堿性陰離子交換樹脂D303，在上樣流速1Bv/h、上樣量25mg/mL、洗脫溫度45℃、洗脫鹽酸濃度0.15M條件下，獲得磷酸肽的氮/磷摩爾比(N/P)為7.21，磷(P)洗脫

3、得率為93.11％。
　　 研究Alcalase、Trypsin、ProteaseN、Papain四種常用蛋白酶在酶膜耦聯(lián)工藝中對(duì)分離純化CPP的影響。四種蛋白酶分別在各自最佳的水解工藝條件下在超濾酶膜反應(yīng)器中進(jìn)行連續(xù)酶解反應(yīng)。通過測(cè)定膜通量J、酪蛋白水解度DH、酶活力變化以及CPP的N/P摩爾比和得率等數(shù)據(jù)，分析確定最適的蛋白酶。研究結(jié)果表明：Alcalase在反應(yīng)過程中殘余酶活力最高，酶泄漏最少，并且受熱力學(xué)作用、機(jī)械剪切作

4、用及膜吸附作用的影響小，酪蛋白的水解度及CPP得率較高，適合于本工藝生產(chǎn)制備CPP。
　　 本文在關(guān)注膜型號(hào)及超濾條件對(duì)CPP得率和N/P摩爾比的影響同時(shí)，重點(diǎn)研究了其對(duì)酶泄漏、膜通量降低及膜污染的影響。選用Alcalase分別在截留分子量為3kDa、5kDa、10kDa的切向流超濾酶膜反應(yīng)器(EMR)中對(duì)酪蛋白進(jìn)行連續(xù)水解。通過測(cè)定膜通量J、酪蛋白水解度DH、蛋白質(zhì)回收率Sapparent、酶活力變化及CPP得率、N/P摩爾比

5、等數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)分析，確定合適的膜型號(hào)及超濾條件。結(jié)果表明：低分子量超濾膜對(duì)酶的截留率達(dá)到90％以上，但膜通量較低，膜污染嚴(yán)重，產(chǎn)品得率低；高分子量超濾膜酶泄漏嚴(yán)重，但可以獲得低N/P摩爾比及高得率的CPP。研究還發(fā)現(xiàn)：增大超濾壓力會(huì)導(dǎo)致膜通量和蛋白質(zhì)回收率的大幅度提高，但會(huì)促使酶大量泄漏并對(duì)膜造成嚴(yán)重的污染。相反提高循環(huán)流量為140mL/min時(shí)，酶泄漏較少，膜污染程度相對(duì)降低，并可獲得較高的蛋白質(zhì)回收率。
　　 本研究實(shí)現(xiàn)了具