酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合體對發(fā)酵乳桿菌生長、產(chǎn)酸及粘附影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合體(Casein phosphopeptide-Amorphic Calcium Phosphate，CPP-ACP)對發(fā)酵乳桿菌生長、產(chǎn)酸及粘附的影響，從而進(jìn)一步弄清CPP-ACP的防齲機(jī)制，探討CPP-ACP作為一種生物防齲制劑的可行性，為其臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。 方法： 1．將發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)分離株413在BHI瓊脂平板培養(yǎng)基中37℃厭氧

2、(80％N2、10％H2、10％CO2)復(fù)蘇48h，取典型菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)增菌24h。涂片檢查為純培養(yǎng)后，將菌液在4℃以3000r/min離心15分鐘，收集細(xì)菌，BHI液體培養(yǎng)基調(diào)整為OD550nm=0.52的菌懸液。在實(shí)驗(yàn)組BHI液體培養(yǎng)基中加入不同濃度(0.5～5.0％(W/V))的CPP-ACP溶液，厭氧培養(yǎng)48h，離心，收集細(xì)菌，去上清后加200ul生理鹽水，再加入20ul MTT溶液，厭氧孵育4h，1200

3、0r/min離心10分鐘，去上清后加入150ul二甲亞砜，振蕩混勻充分溶解后，吸上清于微孔板中，以酶標(biāo)儀測量550nm發(fā)酵乳桿菌甲臜產(chǎn)物的吸光度A值。 2．將發(fā)酵乳桿菌分離株413典型菌落接種于Bm液體培養(yǎng)基，37℃厭養(yǎng)培養(yǎng)增菌18h，離心，收集細(xì)菌，無菌生理鹽水調(diào)整為OD540nm=1.0的菌懸液。按菌液與液體培養(yǎng)基比例為1：10(v、v)，將菌液加入初始pH值為7.4，含不同濃度(0.5～5.0％(W/V))CPP-ACP的

4、1％蔗糖培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48h，收集上清液，用精密pH計(jì)檢測培養(yǎng)基上清液的pH值，計(jì)算pH的變化值△pH(初始pH值-終末pH值)。 3．采用Gibbons創(chuàng)立的，以唾液包被的羥磷灰石(Saliva-coated hydroxyapatite，S-HA)形成實(shí)驗(yàn)性膜的體外粘附實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢l(fā)酵乳桿菌分離株413典型菌落接種于含3.7×105Bq/ml3H-TdR的BHI培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)18h，離心，收集細(xì)菌，用KC1緩沖液

5、洗菌，重懸于含5 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的KC1緩沖液中，分光光度計(jì)調(diào)整菌液濃度OD540nm=0.5。將菌液加入經(jīng)不同濃度(0.5～5.0％(W/V))CPP-ACP處理后的S-HA中，室溫下以6r/min旋轉(zhuǎn)1.5h，KC1緩沖液洗滌后，加入3ml閃爍液定量觀察發(fā)酵乳桿菌分離株413在S-HA粘附的情況。 結(jié)果： 1．CPP-ACP對發(fā)酵乳桿菌分離株413的生長具有抑制作用，發(fā)酵乳桿菌分離株413甲臜產(chǎn)物的

6、二甲亞砜溶液吸光度A值隨CPP-ACP濃度不同而有差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01。吸光度A值隨CPP-ACP濃度增大而降低，即培養(yǎng)基中發(fā)酵乳桿菌的濃度隨CPP-ACP濃度的升高而降低，當(dāng)CPP-ACP濃度達(dá)到2.5％以后，吸光度A值處于一個(gè)低水平的穩(wěn)定狀態(tài)，各組之間的差異不再具有顯著性，p＞0.05。 2．將發(fā)酵乳桿菌加入含不同濃度CPP-ACP的蔗糖液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)物上清液的終末pH值隨CPP-AC

7、P的濃度不同而有差異且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01。培養(yǎng)基上清液的pH值隨CPP-ACP濃度的增大而升高，當(dāng)CPP-ACP濃度大于2.0％時(shí)，終末pH位于臨界pH5.5以上。而隨CPP-ACP濃度的升高，△pH降低，即發(fā)酵乳桿菌分離株413的產(chǎn)酸量降低，p＜0.01。 3．發(fā)酵乳桿菌分離株413對CPP-ACP處理后的S-HA粘附能力明顯下降。經(jīng)各實(shí)驗(yàn)濃度(0.5～5.0％(W/V))的CPP-ACP處理S-HA，發(fā)酵乳桿菌

8、在處理后的S-HA的粘附量(cpm)與陽性對照組的粘附量(cpm)比較，差異具有統(tǒng)顯著性，p<0.01。發(fā)酵乳桿菌對CPP-ACP處理的S-HA的粘附量(cpm)隨CPP-ACP濃度的升高而降低，都明顯低于陰性對照組的粘附量(cpm)，粘附抑制率達(dá)100％。 結(jié)論： 1．CPP-ACP對發(fā)酵乳桿菌分離株413的生長具有明顯的抑制作用，不同濃度(0.5～5.0％(W/V))的CPP-ACP對發(fā)酵乳桿菌分離株413生長的抑制

9、作用不同，當(dāng)CPP-ACP濃度在2.5％以下時(shí)，抑制作用隨CPP-ACP濃度的升高而增強(qiáng)；當(dāng)CPP-ACP濃度達(dá)到2.5％以上時(shí)，抑制作用不再隨著CPP-ACP濃度增加而顯著增強(qiáng)，處于一個(gè)相對穩(wěn)定的狀態(tài)。 2．CPP-ACP對發(fā)酵乳桿菌分離株413的產(chǎn)酸也具有抑制作用，且隨CPP-ACP濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)CPP-ACP的濃度高于2.0％時(shí)可使發(fā)酵乳桿菌分離株413培養(yǎng)物的終末pH值高于臨界pH值5.5，能有效抑制牙體硬組