兩種盔孢傘菌絲體人工培養(yǎng)及毒素檢測.pdf

1、鵝膏毒肽是一類毒性極大的毒素，其作用機理主要是抑制真核生物RNA聚合酶Ⅱ的活性，作為重要的生化試劑在醫(yī)學生物學、分子生物學、細胞生物學、發(fā)育生物學等學科的研究中有廣泛的應用。鵝膏毒肽主要存在于鵝膏屬真菌中，另外也存在于盔孢傘屬的一些種類中，由于鵝膏菌大多為外生菌根菌，對其進行人工培養(yǎng)很困難，因此，目前鵝膏毒肽主要提取自野生鵝膏菌子實體;因資源有限，造成鵝膏毒肽價格昂貴?？邆阕鳛楦?，培養(yǎng)相對容易。本論文首先對盔孢傘菌絲體進行人工培養(yǎng)

2、，進而對其子實體和菌絲體進行鵝膏毒肽的檢測。
　　本文研究的盔孢傘分別采自于湖南瀏陽縣、湖南綏寧縣、湖南保靖縣和新疆烏魯木齊。通過傳統(tǒng)的形態(tài)比較和現(xiàn)代的ITS序列比對的方法進行菌種的鑒定，確定上述四地采集的標本共有兩種;其中，湖南瀏陽、綏寧、保靖所采標本為同一種，即條蓋盔孢傘[Galerinasulciceps(Berk.) Singer]，而新疆所采標本為紋緣盔孢傘[Galerinamarginata(Batsch) Kuhne

3、r];通過篩選，選擇采自于瀏陽和新疆的標本進行后續(xù)實驗。
　　本文采用孢子分離和組織分離法分離出以上兩種盔孢傘。在此基礎上，進行菌絲體的純培養(yǎng)，并對菌絲體和子實體進行測序，得到ITS序列，進行比對后發(fā)現(xiàn)兩者的菌絲體和用于分離的子實體具有完全相同的ITS序列，因此可以認定分離所得菌絲體為對應盔孢傘的菌種。通過培養(yǎng)基的篩選，確定最適基礎培養(yǎng)基，再通過單因子篩選，分別對碳源、氮源、pH、溫度進行了篩選實驗，分別確定兩個菌種的最適培養(yǎng)條件

4、。最后，分別提取兩種盔孢傘子實體、菌絲體以及液體培養(yǎng)發(fā)酵液的毒素，再利用HPLC進行檢測，確定鵝膏肽類毒素種類和毒素含量。
　　通過固體基礎培養(yǎng)基篩選，確定HSVA為最適基礎培養(yǎng)基;通過單因子篩選，發(fā)現(xiàn)兩個種的最適氮源均為蛋白胨(1 g/L)+NH4CL(0.1g/L);最適碳源均為葡萄糖，但紋緣盔孢傘G.marginata對糖濃度的需求量略高;最適合菌絲體生長的溫度均為20℃;均具有較廣的pH值適應范圍。通過液體培養(yǎng)基的篩選，發(fā)

5、現(xiàn)條蓋盔孢傘G.sulciceps的最適碳源為葡萄糖，紋緣盔孢傘G.marginata的最適碳源為紅糖;且兩個種的最適pH值均為6。通過HPLC，檢測出條蓋盔孢傘G.sulciceps的子實體毒素含量為1795.3μg/g干重的α-Ama和1925.0μg/g干重的β-Ama，紋緣盔孢傘G.marginata的子實體毒素含量為445.4μg/g干重的α-鵝膏毒素(α-Ama)和527.0μg/g干重的β-鵝膏毒素（β-Ama）;對這兩種