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文檔簡介
1、毛頭鬼傘[Coprinus comatus(Mueller.ex Fr.)S.F.Grayl],俗稱雞腿菇、雞腿蘑,是一種食、藥用真菌,其肉質(zhì)細嫩,鮮美可口,色香味俱全。藥用味甘滑,性平,有益脾胃,清心安神,治痔等功效。據(jù)文獻報道,毛頭鬼傘主要具有降血糖、降血脂、增強免疫、抗腫瘤、抑菌等作用。目前關(guān)于毛頭鬼傘的研究,大多集中在其栽培技術(shù)和營養(yǎng)成分方向的研究,而對于毛頭鬼傘多糖的提取、分離純化和組成,以及生物活性作用探討等方面還報道不多,
2、特別是均一多糖的結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性研究還未見報道;同時,獲得食藥用菌多糖的途徑有兩種,一種是從子實體中提取,一種是從發(fā)酵產(chǎn)物中獲取。采用深層發(fā)酵培養(yǎng)毛頭鬼傘菌絲體,生產(chǎn)周期縮短,且生產(chǎn)工藝簡便,材料易得,生產(chǎn)成本大幅下降,因此利用液態(tài)深層發(fā)酵是開發(fā)毛頭鬼傘活性成分的一條有效途徑。為了系統(tǒng)的研究毛頭鬼傘菌絲體多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性,本研究對毛頭鬼傘菌絲體進行了深層發(fā)酵,并對其菌絲體多糖進行了提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和免疫活性研究。
3、 本論文共有四個部分,分別從菌絲體的深層發(fā)酵、多糖分離、純化和理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)鑒定和免疫活性進行了研究。主要結(jié)果如下: 1、毛頭鬼傘菌絲體的深層發(fā)酵研究本章比較了毛頭鬼傘正常(CN)菌絲體和太空種(CS)菌絲體的生長勢和生長代謝曲線,CN菌絲體生長勢、多糖總量和生物量均優(yōu)于CS菌絲體,它們的生長代謝曲線基本相似,因此,選擇CN進行全面的研究。 在3 L發(fā)酵罐中,轉(zhuǎn)速在120~180rpm,通氣量在1.2~2.4 L/mi
4、n范圍內(nèi),以菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為指標(biāo)時,轉(zhuǎn)速為180rpm,通氣量為2.4L/min是最優(yōu)的轉(zhuǎn)速和通氣量。在30L發(fā)酵罐中,培養(yǎng)條件為:26℃,工作體積為2/3,10%的接種量,在O~24h中,轉(zhuǎn)速為150rpm,通氣量為10L/min;在24~96h中,轉(zhuǎn)速為200rpm,通氣量為20L/min,發(fā)酵4天。發(fā)酵5個批次,菌絲體生物量最高達17.26g/L。 2、毛頭鬼傘菌絲體多糖分離純化和理化性質(zhì)研究毛頭鬼傘菌絲體經(jīng)9
5、5%乙醇脫脂后,依次經(jīng)過沸水、堿液提取,得到水提粗多糖C30、C60、C80、C80s和堿提水溶性多糖CAP五個組分。毛頭鬼傘菌絲體水提多糖的總得率(包括C30、C60和C80)為15.6%,要比子實體(6.5%)高2.4倍。通過單糖組成分析結(jié)果表明,毛頭鬼傘菌絲體多糖主要由Glc、Gal、Fuc組成。C30、C60、C80組分經(jīng)離子柱(DEAE-Sepharose Fast Flow)和凝膠柱(Sephacryl S100~500填料
6、)層析分離純化,共得到14個多糖,通過高效液相色譜檢測為均一多糖。 3、毛頭鬼傘菌絲體三種均一多糖的結(jié)構(gòu)鑒定通過糖組成分析、甲基化分析、IR和NMR譜(一維:<'1>H NMR譜,<'13>C NMR譜,二維:COSY譜,TOCSY譜,HMQC譜,HMBC譜和NOESY譜)等方法,研究了其中3種均一多糖C30-FA3、C60-FA1和C60-FB1的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 ①C30-FA3的結(jié)構(gòu)分析均一多糖C30-FA3的分子量為1
7、.03×10<'4>Da,糖組成為Fue∶Gal=1∶4.02。C30-FA3甲基化分析結(jié)果表明,巖藻糖以端基方式連接,半乳糖主要以1,6-和1,2,6-兩種方式連接,三個主要的連接方式的摩爾比為1.15∶2.88∶1。由NMR進一步分析結(jié)果表明,C30-FA3主要由(1,6)-α-D-Galp糖殘基構(gòu)成主鏈,在O-2位被α-L-Fucp糖殘基取代的五個單糖殘基組成的結(jié)構(gòu)重復(fù)單元。 ②C60-FA1的結(jié)構(gòu)分析均一多糖C60-FA
8、1的分子量為1.03×10<'4>Da,糖組成為Fuc∶Gal∶Glc=1∶3.04∶0.53。C60-FA1甲基化分析結(jié)果表明,巖藻糖以端基方式連接,半乳糖主要以1,6-和1,2,6-兩種方式連接,三個主要的連接方式的摩爾比為1∶2.04∶0.91,含有少量1,4-和1,6-連接方式的葡萄糖。由NMR進一步分析結(jié)果表明,C60-FA1主要由(1,6)-α-D-Galp糖殘基構(gòu)成主鏈,在O-2位被α-L-Fucp糖殘基取代的四個單糖殘基
9、組成的結(jié)構(gòu)重復(fù)單元。 ③C60-FB1的結(jié)構(gòu)分析@2 均一多糖C60-FB1的分子量為16.69×10<'4> Da,糖組成為Glc,是非淀粉類新葡聚糖。C60-FB1甲基化分析結(jié)果表明,葡萄糖以1,4-方式連接,少量葡萄糖以端基方式連接。C60-FB1的主要結(jié)構(gòu)重復(fù)單元為: 4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→可能以自由卷曲結(jié)構(gòu)存在。 4、毛頭鬼傘菌絲體多糖的體外免疫活性研究對分離純化過程中的各
10、多糖組分和最終獲得的均一多糖進行體外免疫活性試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C30、C60、C80三種粗多糖對淋巴細胞均有刺激淋巴細胞增殖作用,且三者的增殖作用相當(dāng),對淋巴細胞的增殖率依次遞減;C80s、CAP對淋巴細胞無增殖作用或增殖作用不大。粗多糖C30、C60、C80經(jīng)離子柱分離后,鹽相各組分對淋巴細胞的增殖作用均要高于水相部分。經(jīng)多步凝膠柱純化最終得到的均一多糖中C30-FB1、C30-FB2、C60-FB2、C60-FB3、C80-FA2、C8
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