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文檔簡介
1、蛋白尿是腎臟疾病最常見的表現(xiàn),也是腎臟疾病持續(xù)進展的重要危險因素。腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)或功能的異常是引起蛋白尿的病理基礎(chǔ)。近年來發(fā)現(xiàn)足細胞裂孔隔膜(SD)及其相關(guān)蛋白分子(如nephrin、CD2AP、podocin和NPHS1等)對于維持腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)極為關(guān)鍵。 Nephrin和CD2AP均為新近發(fā)現(xiàn)的SD主要組成成份,在腎臟中分別定位于SD和足突側(cè)膜,兩者的羧基端相互連接,共同維持SD的正常結(jié)構(gòu)和功能。Nephrin基因(
2、NPHS1)敲除的大鼠和CD2AP基因敲除的小鼠在生后不久均出現(xiàn)大量蛋白尿,最終死于腎功能衰竭,腎組織病理改變均為足細胞足突消失,提示nephrin和CD2AP在蛋白尿發(fā)生中具有重要作用。 近年來,nephrin和CD2AP在蛋白尿發(fā)生機制中作用的研究逐漸增多,但結(jié)果卻不盡一致;對于經(jīng)藥物(如腎上腺糖皮質(zhì)激素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑)干預(yù)后nephrin和CD2AP的表達變化的研究鮮有報道。本課題的研究目
3、的是觀察nephrin和CD2AP在阿霉素腎病大鼠腎小球中的表達變化和意義以及潑尼松、依那普利、氯沙坦對nephrin和CD2AP表達的影響。通過上述研究,進一步了解腎病綜合征(NS)蛋白尿的發(fā)生機制,為NS臨床治療提供理論依據(jù)。 材料和方法1、實驗動物6周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,體重180~200g,兩次尿蛋白定性實驗陰性。 2、實驗方法(1)大鼠阿霉素(ADR)腎病模型的制備及分組:SD
4、大鼠60只隨機分為正常對照組18只和模型組42只。實驗初,正常對照組大鼠一次性尾靜脈注射生理鹽水6ml/kg,模型組大鼠一次性尾靜脈注射阿霉素6mg/kg。2周末24h尿蛋白定量>30mg者為腎病模型成功,再隨機將模型組大鼠分為腎病未治療組(18只)、腎病對照組(6只)、潑尼松組(6只)、依那普利組(6只)和氯沙坦組(6只)。正常對照組和腎病未治療組大鼠分別于注射ADR后2周、4周、6周末各殺檢6只,腎病對照組、潑尼松組、依那普利組及氯
5、沙坦組每日分別予蒸餾水10ml/kg、潑尼松10mg/kg、依那普利10mg/kg、氯沙坦40mg/kg灌胃,持續(xù)4周后殺檢。 (2)采用實時熒光定量PCR,免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測nephrin和CD2AP在阿霉素腎病大鼠腎小球中的表達和分布。 結(jié)果1、24小時尿蛋白定量注射ADR后第1周末,模型組大鼠開始出現(xiàn)尿蛋白,2周末24小時尿蛋白定量為(64±29.58)mg/d,與正常對照組[(5.62±1.61)mg/d]比較
6、差異有顯著性(p<0.01),尿蛋白排泄?jié)u增加至6周末達到(337.67±38.11)mg/d。經(jīng)潑尼松、依那普利和氯沙坦治療2周后尿蛋白量較腎病對照組無顯著差異,治療4周后24小時尿蛋白定量分別為(86.44±28.73)mg/d、(105.09±51.3)mg/d、(105.44±55.41)mg/d,均較腎病對照組[(342.67±41.11)mg/d]明顯降低(p<0.01),三個治療組間尿蛋白量差異無顯著意義。 2、血
7、生化檢測結(jié)果腎病未治療組2周末血白蛋白[(25±1.54)g/L]低于正常對照組[(30.5±1.08)g/L],差異有顯著性(p<0.01);膽固醇[(2.7±1.3)mmol/L]高于正常對照組[(1.24±0.11)mmol/L],p<0.05,此種差異直至6周;兩組間各時間點尿素氮、肌酐均未見明顯差異。經(jīng)潑尼松、依那普利、氯沙坦治療4周后血白蛋白分別為(24.94±3.36)g/L、(23.74±2.42)g/L、(23.74±
8、1.81)g/L,較腎病對照組[(19.6±1.14)g/L]均不同程度回升(p<0.05),膽固醇、尿素氮及肌酐無明顯差異。 3、腎臟病理正常對照組腎臟光鏡和電鏡均未見病變。腎病未治療組大鼠6周時有少量腹水,腎臟外觀蒼白、腫脹。光鏡下腎病未治療組2周時腎小球無明顯病變,4周時腎小球系膜細胞輕中度增生,6周時系膜增生加重,部分有節(jié)段性硬化及毛細血管腔有血栓,各治療組腎小球系膜增生較腎病對照組減輕,未見硬化。電鏡下腎病未治療組2周
9、時足細胞足突變形、部分融合,4周時足突融合加重,6周時足突彌漫性融合、部分斷裂及消失,基底膜部分增厚,內(nèi)皮細胞窗孔消失。各治療組足突病變較腎病對照組減輕。 4、免疫組織化學(xué)結(jié)果正常對照組nephrin和CD2AP免疫組織化學(xué)染色顯示為沿腎小球毛細血管袢線樣分布。腎病組腎小球nephrin和CD2AP分布異常,從沿毛細血管袢線樣分布逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檫B續(xù)性顆粒樣或節(jié)段性斑片狀分布,染色區(qū)域擴大。半定量分析示:腎病未治療組nephrin表達
10、2周時(9.44±0.49)開始高于正常對照組(8.13±0.85),p<0.05,并呈進行性增高直至6周(12.6±1.12比0.28±0.03),p<0.05。CD2AP表達2周時與正常對照組無明顯差異,4周時(7.88±1.01)高于正常對照組(6.61±0.56),p<0.05,增高直至6周(10.07±2.09比7.04±0.62),p<0.01。 經(jīng)潑尼松、依那普利、氯沙坦治療后nephrin表達分別為11.3±0.
11、71、11.22±0.99、10.83±1.93,較腎病對照組(13.0±1.64)下降,p<0.05;CD2AP表達分別為8.05±1.53、8.67±1.21、8.30±1.50,較腎病對照組(10.4±1.14)下降,p<0.01。三個治療組間nephrin和CD2AP表達無顯著差異。 5、Nephrin、CD2APmRNA表達變化腎病未治療組nephrinmRNA表達2周時(4.80±0.08)顯著高于正常對照組(2.1
12、7±0.12),p<0.01,且逐漸增高至6周(8.55±0.25比1.97±0.31),p<0.01。CD2APmRNA表達2周時無明顯差異,4周時(0.42±0.04)高于正常對照組(0.24±0.01),p<0.01,增高至6周(0.64±0.04比0.28±0.03),p<0.01。 經(jīng)潑尼松、依那普利、氯沙坦治療后nephrinmRNA表達分別為4.69±0.74、6.23±0.12、5.15±0.11,均低于腎病對照
13、組(8.57±0.27),p<0.01;CD2APmRNA表達分別為0.37±0.04、0.51±0.04、0.44±0.03,均較腎病對照組(0.66±0.05)下降,p<0.01。三個治療組間nephrin和CD2APmRNA表達差別均顯著(p<0.01),以潑尼松組下降最明顯。 6、相關(guān)分析NephrinmRNA、CD2APmRNA表達與24小時尿蛋白定量間均具有正相關(guān)關(guān)系(r=0.878,p<0.01;r=0.945,p
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