AIF在阿司匹林抗慶大霉素耳毒性中的作用研究.pdf

1、背景：
　　內(nèi)耳的毛細(xì)胞比較容易受到有耳毒性藥物的損傷,例如某些化學(xué)藥品、化療藥品以及氨基糖甙類抗生素等。以往大量研究表明耳毒性藥物是通過引起毛細(xì)胞凋亡的方式,導(dǎo)致毛細(xì)胞死亡,而Caspase通路被認(rèn)為在耳毒性藥物引起毛細(xì)胞死亡過程中起重要作[1-4]。然而近期有研究者在對慶大霉素耳毒性的研究中,通過使用Caspase抑制劑z-vad-fmk的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),使用了抑制劑后耳毒性藥物引起毛細(xì)胞死亡的情況未得到減輕,實(shí)驗(yàn)動物的聽力未得到

2、明顯保護(hù),從而提出慶大霉素致聾過程中,除了經(jīng)典的caspase通路引起細(xì)胞凋亡外,還存在一條非 caspase依賴凋亡通路[4],即AIF凋亡通路,并且發(fā)揮了一定的作用。正常生理狀態(tài)下,AIF[5-8]是一種位于線粒體內(nèi)膜上的黃素蛋白,發(fā)揮著氧化還原酶的作用,當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡刺激信號后,AI F從線粒體內(nèi)釋放入細(xì)胞質(zhì)內(nèi),并進(jìn)入細(xì)胞核,發(fā)生核轉(zhuǎn)位,引起細(xì)胞核內(nèi)染色體凝集以及大分子DNA片段斷裂,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。我科在1999年-2003年與

3、美國密歇根大學(xué)聽力研究中心聯(lián)合開展了臨床阿司匹林預(yù)防慶大霉素耳毒性的隨機(jī)對照試驗(yàn),研究表明,同時(shí)伍用阿司匹林的患者可以有效減輕慶大霉素的耳毒性損傷[9,10]。但阿司匹林在抗慶大霉素耳毒性的過程中是如何發(fā)揮作用的尚不清楚,AI F是否參與了毛細(xì)胞凋亡尚不清楚以及 AI F在阿司匹林抗慶大霉素耳毒性的過程中的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過制作慶大霉素內(nèi)耳損傷大鼠模型,利用ABR檢測、耳蝸改良基底膜鋪片、免疫熒光染色、RT-PCR、以

4、及 Western-blot等技術(shù),觀察兩組大鼠聽力、毛細(xì)胞形態(tài)變化以及毛細(xì)胞凋亡過程中AIF的表達(dá)變化。以研究AIF在阿司匹林抗慶大霉素耳毒性中的表達(dá)及作用研究。
　　目的：
　　通過使用慶大霉素?fù)p傷大鼠內(nèi)耳模型,證實(shí)阿司匹林對慶大霉素的預(yù)防作用,同時(shí)觀察在阿司匹林抗慶大霉素耳毒性過程中細(xì)胞凋亡的情況,以及 AI F的毛細(xì)胞凋亡過程中的表達(dá)情況,以及阿司匹林抗慶大霉素耳毒性過程中AIF發(fā)揮的作用。
　　方法：

5、　　通過使用慶大霉素制作大鼠內(nèi)耳損傷模型,實(shí)驗(yàn)分為單獨(dú)使用慶大霉素的損傷組(GM組)和阿司匹林+慶大霉素的保護(hù)組(ASA+GM組)。通過使用以下實(shí)驗(yàn)方法:1、利用ABR檢測2組大鼠聽力情況;2、利用耳蝸鋪片+免疫熒光技術(shù),進(jìn)行2組大鼠耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察;3、采用全耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)方法[11],觀察2組耳蝸毛細(xì)胞的缺失情況;4、利用免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察2組細(xì)胞核的形態(tài)、AIF的表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位情況;5、使用Real-time

6、PCR和Western-blot方法檢測2組基底膜AI F的表達(dá)情況。通過以上實(shí)驗(yàn)方法觀察阿司匹林抗慶大霉素耳毒性的作用,AI F的表達(dá)情況以及AI F所發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果：
　　1、ASA+GM組大鼠在用藥第7d、14d、21d檢測ABR,不同頻率的閾值均低于GM組(P<0.05);2、ASA+GM組大鼠毛細(xì)胞缺失率明顯小于GM組(P<0.05);3、ASA+GM組發(fā)生凋亡的細(xì)胞較GM組明顯減少,同時(shí)AIF核轉(zhuǎn)位情況較

7、GM組少。4、Real-time PCR和Western-blot結(jié)果顯示ASA+GM組AIF的表達(dá)量少于GM組(P<0.05)。綜上,同時(shí)服用阿司匹林有較好的預(yù)防慶大霉素耳毒性的作用,AIF在阿司匹林抗慶大霉素耳毒性過程中參與了毛細(xì)胞的凋亡,且在GM組觀察到毛細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)AIF發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,而在ASA+GM組AIF發(fā)生核轉(zhuǎn)位情況較少,同時(shí)Western-blot結(jié)果也顯示GM組AIF的蛋白量明顯高于ASA+GM組(p<0.0

8、5),因此推測,阿司匹林抗慶大霉素耳毒性過程中有可能是通過抑制AIF發(fā)生核轉(zhuǎn)位,從而減少毛細(xì)胞凋亡達(dá)到保護(hù)聽力的作用。
　　結(jié)論：
　　慶大霉素耳毒性可以造成耳蝸毛細(xì)胞的死亡,而這種死亡大部分是通過細(xì)胞凋亡的方式,且 AI F在細(xì)胞發(fā)生凋亡過程發(fā)揮重要作用,阿司匹林可以明顯的減輕慶大霉素的耳毒性,且可以減少毛細(xì)發(fā)生凋亡。綜上推測,阿司匹林抗慶大霉素耳毒性過程中有可能是通過抑制 AI F發(fā)生核轉(zhuǎn)位,從而減少毛細(xì)胞凋亡,進(jìn)而保護(hù)