內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CHOP在慶大霉素誘導(dǎo)的耳、腎毒性中的作用.pdf

1、前言：
　　 耳腎毒性作為藥物的副作用影響著一些臨床藥物的應(yīng)用。產(chǎn)生耳、腎毒性的藥物包括腫瘤化療藥（順鉑）、非類固醇抗炎鎮(zhèn)痛藥（阿司匹林）、氨基糖苷類抗生素（鏈霉素、卡那霉素、新霉素、慶大霉素）等。慶大霉素(Gentamincin，GM)是一種氨基糖苷類抗生素(Aminoglycoside antibiotics，AmAn)，由Weinstein于1963年發(fā)現(xiàn)，可通過全程阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)合成影響細(xì)胞膜通透性而對需氧革蘭陰性桿菌起

2、到抑菌或殺菌作用。90％以上的GM不經(jīng)肝臟代謝而以原有的形態(tài)從腎小管尤其是近曲小管排出。其副作用主要是對內(nèi)耳耳蝸、前庭和腎臟的損傷，毒性機制尚不完全清楚。GM中毒性耳聾的發(fā)病機制包括自由基損傷學(xué)說[1]、內(nèi)耳微循環(huán)障礙學(xué)說[2]、毛細(xì)胞線粒體功能失常學(xué)說和細(xì)胞凋亡[3,4]等。
　　 為進一步探討上述機制，本研究采用肌肉注射GM構(gòu)建大鼠耳腎毒性模型。前期研究應(yīng)用Affymetrix2302.0大鼠全基因組芯片獲得了GM給藥組和正

3、常對照組新生大鼠耳、腎和肝組織基因差異表達(dá)譜，并對耳腎毒性的相關(guān)基因進行了分析。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)涉及免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死等過程的基因表達(dá)出現(xiàn)了上調(diào)或下調(diào)，與耳腎毒性相關(guān)的基因有21個，其中CHOP即DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3（DNA-damage inducible transcription3，Ddit3）的表達(dá)發(fā)生上調(diào)。
　　 CHOP為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）特異性轉(zhuǎn)錄

4、因子，在哺乳動物體內(nèi)廣泛表達(dá)。生理條件下，CHOP主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，含量較低。發(fā)生ERS時，CHOP被大量誘導(dǎo)表達(dá)并聚集于細(xì)胞核內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞凋亡，該過程是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、折疊、修飾和分泌的場所。在生理條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)載的蛋白和其折疊能力處于平衡狀態(tài)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成過多時，未折疊蛋白聚集，鈣離子平衡和氧化還原反應(yīng)受到破壞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，從而誘發(fā)ERS[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded

5、 proteinresponse，UPR)來抵抗ERS引起的細(xì)胞損傷[6]，恢復(fù)細(xì)胞功能。但損傷持續(xù)或過于嚴(yán)重時，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)將不能及時恢復(fù)，并可能引起細(xì)胞凋亡。
　　 本研究通過探討CHO等ERS相關(guān)基因在GM所致大鼠耳腎毒性組織中的表達(dá)情況，討論內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡在耳腎毒性中的作用。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、健康新生Wistar大鼠40只
　　 2、HE染色相關(guān)試劑<

6、br>　　 3、肌酐和尿素氮檢測相關(guān)試劑
　　 4、Western B1ot相關(guān)試劑
　　 5、Real-time PCR實驗相關(guān)試劑
　　 6、免疫組化及TUNEL相關(guān)試劑
　　 二、實驗方法
　　 1、新生大鼠隨機分組，肌肉注射GM一周后，取耳蝸和腎組織。
　　 2、通過尿素氮肌酐檢測判斷腎損傷程度，HE染色查看組織水平的耳腎損傷程度。
　　 3、運用Real-time PC

7、R技術(shù)驗證CHO基因等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因在耳腎組織中的表達(dá)情況。通過Western Blot技術(shù)，檢測CHOP蛋白表達(dá)情況。
　　 4、采用免疫組化和TUNEL對組織中CHOP表達(dá)情況及細(xì)胞凋亡情況進行評估。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、GM誘導(dǎo)的耳蝸和腎組織中，CHOP在腎的高劑量組和耳蝸的中、高劑量組中表達(dá)上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化。
　　 2、CHOP蛋白表達(dá)升高與凋亡并存。