五味子活性成分的篩選及其對心肌缺血-再灌注的保護(hù)作用.pdf

1、目的：南五味子（SSF）和北五味子（SCF）在傳統(tǒng)中醫(yī)中常作為滋補(bǔ)藥使用，近年研究表明五味子具有保護(hù)心肌的作用，但是具體的藥效成分不明。本課題建立心肌細(xì)胞膜-液質(zhì)聯(lián)用的分析方法對南北五味子的活性成分進(jìn)行了篩選，并系統(tǒng)觀察了活性成分對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的作用。
　　方法：首先建立心肌細(xì)胞膜色譜-液質(zhì)離線聯(lián)用的分析方法（CM/CMC-Offline-LC/MS），并用此方法篩選、鑒定南北五味子提取物中的活性成分。此方法是采用大鼠

2、心室肌細(xì)胞制備心肌細(xì)胞膜（CM/CMC）色譜柱的固定相；采用陽性藥物對照品尼群地平（NT）、硝苯地平（NF）和陰性藥物對照品格列齊特（GC）、格列美脲（GM）考察CM/CMC-Offline-LC/MS方法的適用性和可靠性；將SCF和SSF提取物分別進(jìn)入CM/CMC色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離、篩選；收集CM/CMC上的保留組分，在優(yōu)化條件下進(jìn)入液質(zhì)（LC/MS）系統(tǒng)進(jìn)行分析、鑒定活性成分。
　　其次，通過超聲分散-高壓納米機(jī)法分別制備五味子

3、甲素（DSD）、五味子酯甲（STA）靜脈注射亞微乳劑，該乳劑以大豆卵磷脂為乳化劑、注射用油為油相。并采用高效液相色譜法測定了DSD和STA的含量。
　　最后，構(gòu)建大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，系統(tǒng)觀察了DSD和STA對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中以雄性Wistar大鼠經(jīng)可逆性結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立在體心肌缺血/再灌注損傷模型，分別尾靜脈注入DSD和STA乳劑，通過測定心功能、心肌梗塞面積、生化指標(biāo)、組織病理學(xué)、心肌

4、細(xì)胞凋亡以及心肌中caspase-3蛋白、gp91phoxmRNA表達(dá)的變化；分離新生大鼠心肌細(xì)胞，DSD或STA預(yù)處理后再以H2O2損傷，用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞的凋亡情況，考察DSD和STA對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：通過CM/CMC-Offline-LC/MS方法從SSF、SCF中篩選出的活性成分DSD和STA可以與心肌細(xì)胞膜結(jié)合，提示其可能具有保護(hù)心肌的作用。課題所制得的靜脈注射亞微乳劑含量穩(wěn)定，且克服了

5、DSD和STA溶解度差的問題。
　　藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(i)DSD和STA可明顯減輕缺血/再灌注后LVSP、LVEDP、±dp/dtmax和心律失常指標(biāo)的異常變化，顯示有改善心功能效應(yīng)；(ii)DSD和STA能減小心肌梗塞面積，降低MDA的釋放，增加SOD活力，顯示有減輕心肌損傷的效應(yīng)；(iii)3.組織形態(tài)學(xué)觀察和心肌紋理分析也表明DSD和STA有減輕心肌組織病理損害的作用；(iv)與缺血再灌注組比較，DSD和STA可顯著減少心

6、肌細(xì)胞凋亡（由缺血/再灌注組的33.56±2.58％減少為10.28±2.80%和10.98±1.99%），并降低caspase-3的活性（由缺血/再灌注組的0.62±0.02OD/mg減少為0.38±0.02OD/mg和0.32±0.02OD/mg），提示DSD和STA可能具有保護(hù)心肌細(xì)胞的效應(yīng)；(v)研究結(jié)果表明DSD、STA和陽性對照藥美托洛爾可以改善心肌缺血/再灌注損傷，并且作用相似。(vi)體外研究表明，DSD或STA可以明顯