PD98059聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的
　　 卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤之首，由于卵巢癌發(fā)病隱匿，且缺乏特異性的分子生物學(xué)指標(biāo)，使得早期診斷卵巢癌較為困難，大多數(shù)患者常以臨床并發(fā)癥就診，此時(shí)患者已進(jìn)入臨床晚期，加之極易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，患者多失去最佳治療機(jī)會(huì)。目前臨床上針對卵巢癌的治療主要以手術(shù)及化療為主，但卵巢癌化療過程中的毒副反應(yīng)、耐藥性的產(chǎn)生以及治療后的高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響了卵巢癌患者的臨床

2、預(yù)后，因此針對血管生成、腫瘤特異基因的靶向治療等基因生物治療逐漸成為卵巢癌新的臨床治療手段。
　　 含有WW結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶基因(WWOX)，也被稱為WOX1或FOR基因，該基因最早由Bednarek等應(yīng)用鳥槍基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，其作用與細(xì)胞的增殖、分化有密切聯(lián)系，有研究顯示，WWOX基因的作用機(jī)制主要是參與細(xì)胞通路間各產(chǎn)物信息傳遞及基因表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)控。WWOX基因的基因組框架位于16號染色體長臂的23.3-24.1區(qū)，此區(qū)域內(nèi)

3、有FRA16D脆性位點(diǎn)，因此WWOX較易受外界因素影響而發(fā)生突變或缺失，加之WWOX包含9個(gè)外顯子和密碼子，因此其突變具有多樣性。目前研究表明WWOX基因的缺失及突變與人類的多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系，如卵巢癌、血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、肝癌及前列腺癌等。
　　 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）通路作為促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路中的主要成員，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，有研究報(bào)道WWOX可與MEK形成復(fù)合產(chǎn)物從而調(diào)控細(xì)胞的

4、凋亡。關(guān)于WWOX基因在卵巢癌中的具體作用機(jī)制尚未見于臨床報(bào)道。本研究擬通過對ERK通路的干預(yù)，初步闡明WWOX基因表達(dá)與ERK通路間的相互關(guān)系，并為卵巢癌的治療提供新的治療靶點(diǎn)，因此具有重要的理論意義和臨床實(shí)用價(jià)值。
　　 研究方法
　　 本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對象，細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)按不同處理因素將卵巢癌SKOV3細(xì)胞分組:空白對照組、單純PD98059組、單純順鉑組、聯(lián)合用藥組。Cell

5、CountingKit-8(CCK-8)分別檢測各處理組SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中WWOX基因和(ERK)基因表達(dá)水平。Western-bloting檢測各組細(xì)胞中ERK活化狀態(tài)磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)情況。普通光鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞術(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組中SKOV3細(xì)胞凋亡的情況。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)以(x)±s表示，與

6、對照組比較采用t檢驗(yàn)，各處理組之間采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于其他各組(P＜0.05);單純順鉑組及聯(lián)合用藥組WWOXmRNA表達(dá)量較空白對照組明顯增加(P＜0.05)，單純PD98059組WWOX表達(dá)量無明顯改變(P＞0.05);ERKmRNA在各組間的表達(dá)無明顯變化(P＞0.05);單純PD98059組、單純順鉑組及聯(lián)合用藥組p-ERK1/

7、2表達(dá)量均低于空白對照組，單純順鉑組p-ERK1/2表達(dá)量高于單純PD98059組及聯(lián)合用藥組，單純PD98059組與聯(lián)合用藥組間p-ERK1/2表達(dá)量無明顯差異。光鏡下可觀察到空白對照組及單純PD98059組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶，形態(tài)學(xué)無明顯改變;單純順鉑組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞貼壁較少，細(xì)胞水腫明顯，分布稀疏，聯(lián)合用藥組中部分細(xì)胞出現(xiàn)胞漿溶解樣改變。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示，與空白對照組相比，單純PD98059組細(xì)胞早期及晚期細(xì)胞

8、凋亡率間無明顯差異，單純順鉑組及聯(lián)合用藥組早期及晚期凋亡率明顯增加，聯(lián)合用藥組晚期凋亡率明顯高于其他各組。
　　 結(jié)論
　　 1.WWOX基因可與ERK/MEK通路中MEK形成復(fù)合物，通過改變ERK/MEK通路的激活狀態(tài)，調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖與凋亡。
　　 2.聯(lián)合應(yīng)用MEK特異性抑制劑PD98059及順鉑作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞，可通過增加WWOX基因表達(dá)，增加WWOX/MEK復(fù)合物的形成及特異性阻斷ERK/