融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對(duì)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞影響及機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　卵巢癌是目前死亡率最高的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女生命和健康，惡性程度高、起病隱匿、發(fā)現(xiàn)晚、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差是卵巢癌的特點(diǎn)。大約70％的患者就診時(shí)已經(jīng)是晚期(FIGO分級(jí)Ⅲ-Ⅳ期)。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是晚期卵巢上皮性癌綜合治療的重要手段，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的目的是最大限度和范圍地切除腫瘤組織，但術(shù)后可能殘留的病灶仍然無(wú)法避免，且成為卵巢癌復(fù)發(fā)的重要因素。因此化療的應(yīng)用使卵巢癌的治療效果大為改觀，患者生存質(zhì)

2、量明顯改善，但綜合來(lái)看，患者5年內(nèi)的生存率不超過(guò)30%，卵巢癌對(duì)化療藥物耐藥是導(dǎo)致患者治療失敗的主要原因。目前卵巢上皮性癌主要采用以順鉑為基礎(chǔ)的化療方案，但是順鉑的療效會(huì)因癌細(xì)胞內(nèi)在或者后天(藥物誘導(dǎo))獲得的耐藥性而減弱。因此，逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥及卵巢癌耐藥機(jī)制的深入研究尤為重要。目前，分子靶向治療已逐漸成為一種新的腫瘤治療策略，并取得一定的研究成果。本題組前期采用全細(xì)胞差減法成功篩選獲得了與卵巢癌上皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽（ovarian

3、cancer specific binding peptide，OSBP），通過(guò)原核表達(dá)的方法成功獲得了靶向融合肽﹛轉(zhuǎn)錄反式激活因子（trans-activator of transcription， TAT）-OSBP-絲裂原活化蛋白激酶激酶6突變體（E）[mitogen-activated protein kinase k inase6 mutant（E），MKK6（E）]﹜，TAT-OSBP-MKK6（E），是一種靶向卵巢癌上皮細(xì)

4、胞的具有強(qiáng)穿膜能力的靶向融合肽，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明其能靶向介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)紫杉醇的抗腫瘤效應(yīng)。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，以人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP為研究對(duì)象，進(jìn)一步探討TAT-OSBP-MKK6（E）對(duì)人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株 SKOV3/DDP生長(zhǎng)的抑制作用及其可能的機(jī)制，并將其與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于 SKOV3/DDP細(xì)胞，觀察兩者的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)，為探索新的靶向殺滅卵巢癌細(xì)胞的藥物提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的

5、研究提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　利用人上皮性卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株SKOV3/DDP細(xì)胞為研究對(duì)象，探討融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)單用或與順鉑(DDP)聯(lián)用對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的抑制作用及其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　（1）利用 MTT法檢測(cè)融合蛋白 TAT-OSBP-MKK6(E)對(duì)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP的生長(zhǎng)抑制作用，用 transwell檢測(cè)融合蛋白 TAT-OSBP-

6、MKK6(E)對(duì)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP的侵襲與轉(zhuǎn)移的影響；Western blot分析P38MAPK蛋白的表達(dá)；
　?。?）MTT法檢測(cè)融合蛋白 TAT-OSBP-MKK6(E)聯(lián)合順鉑對(duì)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP抑制作用是否增強(qiáng)，光鏡下觀察 TAT-OSBP-MKK6(E)聯(lián)合順鉑對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) TAT-OSBP-MKK6(E)聯(lián)合順鉑對(duì)SKOV3/DDP的凋亡率的影響

7、，Western blot分析細(xì)胞Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá);
　?。?）MDC染色標(biāo)記 TAT-OSBP-MKK6(E)誘導(dǎo) SKOV3/DDP發(fā)生自噬的自噬體；Western blot分析細(xì)胞 LC3-II蛋白的表達(dá)；利用自噬特異性抑制劑氯喹檢測(cè) TAT-OSBP-MKK6(E)誘導(dǎo)SKOV3/DDP發(fā)生自噬的作用
　　（4）利用 P38MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑 SB230580阻斷 P38MAPK

8、信號(hào)通路后，檢測(cè)P38蛋白和LC3-II蛋白的表達(dá)，MTT法檢測(cè)SKOV3/DDP細(xì)胞的生存率。
　　結(jié)果：
　　1.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對(duì)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP的生長(zhǎng)抑制作用
　　以2.5、5、10、20、40和80μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)處理SKOV3/DDP細(xì)胞48h，出現(xiàn)明顯的增殖抑制作用，且呈濃度依賴性。不同的濃度的TAT-OSBP-MKK6(E)處理

9、組與對(duì)照組相比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其IC50為26.94μmol/mL。
　　2. Transwell檢測(cè)融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對(duì)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP的侵襲與轉(zhuǎn)移的能力
　　以0、10、20和40μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)處理SKOV3/DDP細(xì)胞48h后，各處理組穿膜細(xì)胞數(shù)依次為(85±4)、(70±5)、(54±6)和(32±2)個(gè)，隨 TAT-O

10、SBP-MKK6(E)濃度的增加，其對(duì)SKOV3/DDP的侵襲抑制作用越明顯。不同的濃度的TAT-OSBP-MKK6(E)處理組與對(duì)照組相比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同樣遷移作用中，各處理組遷移細(xì)胞數(shù)依次為(708±15)、(683±14)、(141±15)和(113±18)個(gè)，隨TAT-OSBP-MKK6(E)濃度的增加，其對(duì) SKOV3/DDP的遷移抑制作用越明顯。不同的濃度的TAT-OSBP-MKK6(E)處理組與對(duì)照

11、組相比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）
　　3.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對(duì)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP中P38MAPK的蛋白的表達(dá)
　　TAT-OSBP-MKK6(E)在（0-40）μmol/ml的各濃度中可以顯著激活SKOV3/DDP細(xì)胞中的磷酸化水平，并隨藥物濃度的增加磷酸化水平越明顯，且P38MAPK的總量并無(wú)改變。
　　4.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)增加耐順鉑卵巢癌細(xì)胞

12、株SKOV3/DDP對(duì)順鉑的敏感性
　　5μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)單作用于 SKOV3/DDP細(xì)胞的生存抑制率為（13.06±1.089）%，此次20μg/ml順鉑對(duì) SKOV3/DDP細(xì)胞的生存抑制率為（19.02±2.227）%，TAT-OSBP-MKK6(E)（5μmol/ml）+順鉑（20μg/ml）可以顯著提高 SKOV3/DDP細(xì)胞的生存抑制率達(dá)到（54.03±2.382）%。在倒置光學(xué)顯微鏡下

13、觀察結(jié)果顯示，順鉑聯(lián)合 TAT-OSBP-MKK6(E)能夠顯著抑制 SKOV3/DDP細(xì)胞的增殖， SKOV3/DDP細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，皺縮，細(xì)胞呈現(xiàn)為明亮的圓點(diǎn)。
　　5.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)增加耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡率
　　20μg/ml的順鉑，5μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)聯(lián)合作用 SKOV3/DDP細(xì)胞24h，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

14、率。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，20μg/ml順鉑并不能引起 SKOV3/DDP細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，5μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)能引起細(xì)胞凋亡率增加，但作用不明顯，而順鉑聯(lián)合 TAT-OSBP-MKK6(E)引起細(xì)胞凋亡率明顯增高。聯(lián)合組分別與順鉑組、融合蛋白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但對(duì)照組及20μg/ml的順鉑組比較，順鉑聯(lián)合TAT-OSBP-MKK6(E)并沒(méi)有導(dǎo)致Cleaved Caspas

15、e-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，同樣單用5μmol/ml TAT-OSBP-MKK6(E)組中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)減弱。
　　6.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)誘導(dǎo)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP細(xì)胞自噬20μg/ml的順鉑、5μmol/ml TAT-OSBP-MKK6(E)聯(lián)合組呈現(xiàn)了更高的熒光強(qiáng)度和更多的MDC標(biāo)記的細(xì)胞。western blot檢測(cè)當(dāng)20μg/ml的順鉑，5μmol/ml TAT-OS

16、BP-MKK6(E)單用或者聯(lián)合處理耐順鉑卵巢癌24h后，LC3-I逐漸向 LC3-II轉(zhuǎn)化，聯(lián)合組LC3-II蛋白濃度最高，而自噬流發(fā)生的標(biāo)志性蛋白P62的表達(dá)則逐漸減弱。
　　7．融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)誘導(dǎo)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡
　　當(dāng)氯喹（ chloroquine， CQ）和 TAT-OSBP-MKK6(E)聯(lián)用處理細(xì)胞后， LC3-II及P62的聚集較分別用 TAT-

17、OSBP-MKK6(E)單用時(shí)明顯增加，表明 CQ可以有效地阻斷自噬，引起自噬溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷堆積。MTT法的結(jié)果進(jìn)一步顯示，自噬的抑制使TAT-OSBP-MKK6(E)對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的抑制明顯下降。
　　8.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)通過(guò)激活P38MAPK通路誘導(dǎo)自噬增敏順鉑的抗腫瘤作用
　　SB203580作用使 P38蛋白表達(dá)下降，P38蛋白表達(dá)下降后，TAT-OSBP-MKK6(E)誘導(dǎo)的

18、LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化被顯著地抑制。進(jìn)一步應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同處理組的細(xì)胞死亡數(shù)，結(jié)果顯示， TAT-OSBP-MKK6(E)聯(lián)合順鉑處理耐順鉑卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP可以明顯增加細(xì)胞死亡，P38MAPK信號(hào)通路的抑制明顯阻斷了這一增敏作用。
　　結(jié)論：
　　融合蛋白 TAT-OSBP-MKK6(E)可以通過(guò)激活 P38MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡的發(fā)生，從而抑制人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞 SKOV3/DDP細(xì)