腎透明細胞癌及癌旁組織轉錄組差異表達的初步分析.pdf

1、第一部分腎透明細胞癌組織及癌旁組織樣本隊列的構建
　　 目的：探索腎透明細胞癌組織及癌旁組織樣本隊列模型的構建，明確組織性質(zhì)
　　 方法：志愿捐獻術后手術標本病例共9人，年齡從47歲至64歲不等。術前均根據(jù)影像學檢查結果及臨床診斷為腎透明細胞癌。9例病患都選擇進行腎根治性切除手術方式治療，其中術前T1aN0M04例(44.4％)，T1bN0M05例(55.6％)；男性6例(66.7％)，女性3例(33.3％)；年齡分布為

2、55.2±7.1歲。分別選取9例病例術后切除標本中連續(xù)取材腎癌假包膜內(nèi)組織2枚(0.5cm直徑)，連續(xù)取材假包膜2cm外腎臟組織2枚(0.5cm直徑)。對假包膜內(nèi)、外各1枚組織進行4％甲醛溶液脫水、石蠟包埋固定，并以HE染色、Cytokeratin，pan染色以及Vimentin染色明確細胞學形態(tài)以及標志物表達情況；對假包膜內(nèi)、外各另1枚組織進行快速冰凍處理，后用RNA TRIzol試劑盒進行RNA提取。
　　 結果：志愿捐獻術

3、后手術標本病例共9人，年齡從47歲至64歲不等。術前均根據(jù)影像學檢查結果及臨床診斷為腎透明細胞癌。9例病患都進行腎根治性切除手術方式治療男性6例(66.7％)，女性3例(33.3％)；年齡分布為55.2±7.1歲。
　　 1)根據(jù)術后大體標本及腎門淋巴結病理結果：腎腫瘤分期與術前一致，T1aN0M04例(44.4％)，T1bN0M05例(55.6％)。
　　 2)H.E染色分析：從細胞形態(tài)學分析，第6例入組病患為腎嫌色細

4、胞癌，其余8例病例均為腎透明細胞癌；腎包膜外腎臟組織無腫瘤組織侵犯，為正常腎臟組織。
　　 3)免疫組織化學分析：Vimentin染色提示第6例入組病患標記為陰性，其余8例病例均為陽性；腎包膜外腎臟組織均提示染色陰性。
　　 4)抽提RNA質(zhì)量由電泳明確，RNA提取濃度達到實驗要求。
　　 結論：樣本中出現(xiàn)少發(fā)腫瘤并非是我們所能控制的，但術后病理提示的腎細胞癌分期與術前完全一致?？焖俦鶅龇▽τ谀I透明細胞癌組織及假

5、包膜外腎臟組織提取，能夠很好的避免RNA降解的問題。
　　 第二部分 RNA-seq技術檢測腎透明細胞癌組織內(nèi)基因表達水平變化
　　 目的：應用RNA-seq技術對腎透明細胞癌組織轉錄物組進行完全測序，從而從轉錄物水平驗證已知與腎透明細胞癌的相關基因、基因組合或通路；尋找潛在可能的影響腎透明細胞癌細胞增殖、分化以及腫瘤進展的潛在基因組合、通路。
　　 方法：自第一部分試驗中提取的9例病例的腫瘤組織及瘤旁組織的RN

6、A樣本，進行cDNA第一鏈合成，添加測序接頭，按照PCR程序進行40個循環(huán)后，應用Illumina HiSeq2000測序。測序后所獲得的轉錄組表達水平數(shù)據(jù)結合UCSC GenomeBrowser與MsigDB數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)歸一化處理。而后結合應用Blat(Blast-likealignment tool，Blat)、Bowtie、RUM(RNA-Seq unified mapper，RUM)、DEseq、GSEA(Gene Set E

7、nrichment Analysis，GSEA)等基因分析軟件，在染色體、基因組合、基因通路等多種水平分析RNA-seq所獲得的數(shù)據(jù)，從而對已知的相關基因、基因組合或通路的表達水平進行驗證，或發(fā)現(xiàn)一些表達水平存在差異的基因組合或通路。
　　 結果：根據(jù)9例RNA提取樣本RNA-seq轉錄組水平檢測的結果，歸一化處理后，結合多種基因分析軟件，獲得以下結果：
　　 1)通過應用RNA-seq技術所進行的全基因組水平的轉錄組分

8、析，驗證腎透明細胞癌已知的異常基因表達如EGLN3、CA9及VEGFA等，同時第6例腫瘤樣本中所獨特的基因表達，也與第一部分HE染色及免疫組化的結果一致。
　　 2)通過本研究，驗證了現(xiàn)有與腎透明細胞癌發(fā)病機制相關的VHL/HIF通路，同時在染色體水平上也驗證了染色體3p區(qū)域的表達缺失與染色體5q區(qū)域的表達上調(diào)。而第6例樣本在染色體1號、2號及17號區(qū)域上的表達缺失，在染色體3號與7號區(qū)域上的表達上調(diào)都提示我們這是腎嫌色細胞癌的

9、特征，與第一部分的觀察結果一致。
　　 3)本研究更通過對RNA-seq的表達異常基因的集合分析，尋找到35個值得關注的基因組合，驗證了與VHL/HIF通路有關的基因組合在腎透明細胞癌組織中的表達差異，以及有關腎功能的基因組合在癌組織中的表達缺失，并且在染色質(zhì)修飾的相關基因研究中驗證了最近有關PBRM1的外顯子測序結果。
　　 4)通過與NCBI芯片數(shù)據(jù)庫GSE17895與GSE11024中的比對，本研究發(fā)現(xiàn)了RUNX1

10、-RUNX1T1通路相關基因在腎透明細胞癌組織中的特異性表達上升。
　　 結論：我們應用RNA-seq技術對9對腎細胞癌以及癌旁組織進行了轉錄組水平的全基因組測序，RNA-seq技術的全數(shù)字化信號等技術優(yōu)勢得到充分發(fā)揮，有效的驗證了現(xiàn)已知的腎透明細胞癌在相關基因、基因組合以及染色體水平上的特異性表達，并且在研究過程中發(fā)現(xiàn)了與腎透明細胞癌發(fā)病存在相關性的RUNX1-RUNX1T1通路。
　　 第三部分 RUNX1-RUNX

11、1T1通路的初步驗證
　　 目的：驗證RUNX1-RUNX1T1通路在腎透明細胞癌組織中與癌旁組織中表達水平的差異
　　 方法：選取2010年收治于我科的志愿捐獻術后手術標本病例共4人，年齡從49歲至58歲不等。術前均根據(jù)影像學檢查結果及臨床診斷為腎透明細胞癌。4例病患都選擇進行腎根治性切除手術方式治療，其中術前T1aN0M03例(75％)，T1bN0M01例(25％)；男性3例(75％)，女性1例(25％)；年齡分布為

12、55.2±7.1歲。分別選取4例病例術后切除標本中連續(xù)取材腎癌假包膜內(nèi)組織2枚(0.5cm直徑)，連續(xù)取材假包膜2cm外腎臟組織2枚(0.5cm直徑)。對假包膜內(nèi)、外各1枚組織進行4％甲醛溶液脫水、石蠟包埋固定，并以HE染色、Cytokeratin，pan染色以及Vimentin染色明確細胞學形態(tài)以及標志物表達情況；對假包膜內(nèi)、外各另1枚組織進行快速冰凍處理，后用RNA TRIzol試劑盒進行RNA提取。選取RUX1-RUNX1T1通路

13、中的NETO2、GBP2及VCAN基因進行qRT-PCR檢測。
　　 結果：手術標本病例共4人，年齡從49歲至58歲不等。術前均根據(jù)影像學檢查結果及臨床診斷為腎透明細胞癌。4例病患都選擇進行腎根治性切除手術方式治療，其中術前T1aN0M03例(75％)，T1bN0M01例(25％)；男性3例(75％)，女性1例(25％)；年齡分布為53.8±3.3歲。
　　 1)根據(jù)術后大體標本及腎門淋巴結病理結果：腎腫瘤分期與術前一致

14、，T1aN0M03例(75％)，T1bN0M01例(25％)。
　　 2)H.E染色分析：從細胞形態(tài)學分析選取所有4例患者均為腎透明細胞癌。
　　 3)免疫組織化學分析：Cytokeratin，pan染色與Vimentin染色提示所有4例腫瘤組織染色均為陽性。
　　 4)抽提RNA質(zhì)量由電泳明確，RNA提取濃度達到實驗要求。
　　 5)在4例腎透明細胞癌病例的qRT-PCR，NETO2、GBP2及VCAN