白芍總苷對角質(zhì)形成細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子和IL-23表達的影響.pdf

1、背景：
　　 銀屑病是一種常見的由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的慢性炎癥性增殖性皮膚病，其病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明。目前銀屑病發(fā)病的始動觸發(fā)因素仍然不清楚，其發(fā)病機制涉及到免疫系統(tǒng)紊亂、血管新生和角質(zhì)形成細胞增生等多個環(huán)節(jié)。其組織病理學最主要的特征是角質(zhì)形成細胞(keratinocyte，KC)過度增生、炎癥細胞浸潤、新生血管形成。在銀屑病的組織病理變化中真皮乳頭血管的異常最先發(fā)生，而后出現(xiàn)炎癥細胞的移行和表皮增生

2、及分化異常。同時，大量的免疫活性細胞及其分泌的細胞因子滲出到血管外的組織中，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞活化、增殖并分泌大量細胞因子，由此形成細胞因子相互調(diào)控的惡性循環(huán)，促進疾病的進展。
　　 在銀屑病病理過程中，由表皮細胞分泌的很多血管源性細胞因子參與了血管增生，但以血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)最為重要。銀屑病皮損中的KC是促進血管新生細胞因子的主要來源。研究表明，VE

3、GF mRNA及蛋白表達水平在銀屑病患者皮損中明顯增加，患者非皮損處VEGFmRNA及蛋白水平表達亦增加，許多研究又表明嚴重類型的銀屑病患者血清中VEGF水平也顯著升高，且與疾病的活動有一定相關(guān)性。另有報道將編碼VEGF的基因轉(zhuǎn)入小鼠皮膚可致銀屑病樣改變，并出現(xiàn)特征性的Koebner現(xiàn)象，這進一步說明VEGF在銀屑病發(fā)病過程中起到重要作用。同時，銀屑病也是多種炎細胞共同參與的免疫性疾病。IL-23是新近發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，是由本身無生物

4、活性的p19因子與IL-12的p40亞基通過二硫鍵相連組成的異二聚體。能夠誘導(dǎo)記憶性T細胞產(chǎn)生IFN-γ，具有較強的抗感染免疫保護功能和抗腫瘤活性。研究表明銀屑病病人皮損IL-23的表達明顯增高。Piskin等發(fā)現(xiàn)UVB治療銀屑病后，臨床癥狀得到改善，局部皮損IL-23的表達也下調(diào)。因此他們推測，角質(zhì)形成細胞過表達IL-23可能對銀屑病的炎性過程起一定作用。
　　 白芍總苷膠囊(商品名帕夫林，total glucosides o

5、f paeony，TGP)是從中藥白芍中提取的復(fù)合制劑，主要成分包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等，其中芍藥苷占總苷量的90％，是白芍的主要有效成分。其藥理作用主要有抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能、影響細胞增殖、止痛、保肝等作用。TGP對自身免疫過程中的多個環(huán)節(jié)都存在著調(diào)節(jié)作用。研究報道TGP可以抑制VEGF、金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)等活性物質(zhì)的產(chǎn)生。目前國內(nèi)對TGP治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、兒童特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的研究較多，但

6、對TGP治療銀屑病的機制尚不清楚。
　　 促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是哺乳動物細胞中重要的信號通路，能將多種細胞外刺激產(chǎn)生的信號通過級聯(lián)反應(yīng)從細胞膜傳遞到細胞核內(nèi)，在細胞分化、增殖、凋亡、應(yīng)激、炎癥以及免疫反應(yīng)等多種生理和病理過程中發(fā)揮著極其重要的作用。其任一環(huán)節(jié)的異常都可能導(dǎo)致細胞的異常增殖與分化。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括MAPK激酶激酶(

7、MAPK kinase kinase，MAPKKK)、MAPK激酶(MAPK kinase，MAPKK)、MAPK，此通路主要為三級酶聯(lián)反應(yīng)模式：激活因子作用于MAPKKK使其首先被激活，MAPKKK被激活后又能使MAPKK磷酸化而被激活，產(chǎn)生MAPK并激活一系列其它蛋白激酶，使細胞骨架成分磷酸化，亦可經(jīng)核轉(zhuǎn)位進入細胞核激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，完成對細胞刺激的反應(yīng)。細胞因子、生長因子、激素以及各種應(yīng)激刺激都可以作為激活因

8、子激活這個三級酶聯(lián)反應(yīng)。MAPK是MAPK途徑的核心，其底物絕大部分是核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子。MAPKs主要包括3個經(jīng)典的亞家族途徑，即細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulatedkinase1/2，ERK1/2)，p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinases，J

9、NK)。p38是MAPK的亞類之一，主要被炎性細胞因子和環(huán)境應(yīng)激刺激而激活。p38的激活和炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的產(chǎn)生關(guān)系密切，并在角質(zhì)形成細胞的增生和分化中發(fā)揮重要作用。已有研究表明p38MAPK途徑在銀屑病的病理過程中發(fā)揮重要作用。有報道TGP可通過激活p38MAPK，調(diào)節(jié)前炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用，表明TGP的治療作用可能通過調(diào)節(jié)信號通路途徑。因此，為了進一步探討TGP對KC作用的機制，我們

10、選擇Tp38MAPK信號途徑來研究TGP作用的可能機制。
　　 目前，TGP對KC的具體作用還不明確，因此本研究擬在體外培養(yǎng)的人表皮角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞中，以主要由KC分泌的VEGF和IL-23為檢測指標，觀察TGP對體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞的增殖、VEGF和IL-23表達和分泌的影響，及其信號通路的調(diào)控，探討TGP治療銀屑病的可能機制。
　　 目的：
　　 1.觀察TGP對HaCaT細胞增殖的影響；

11、>　　 2.觀察TGP對HaCaT細胞表達VEGF和IL-23的影響；
　　 3.探討P38MAPKs信號傳導(dǎo)途徑在TGP對HaCaT細胞表達VEGF和IL-23調(diào)控中的作用。
　　 方法：
　　 1.HaCaT細胞的培養(yǎng)
　　 永生化的角質(zhì)形成細胞株HaCaT細胞用含10％FBS的1640置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
　　 2.實驗設(shè)計
　　 (1)根據(jù)參考文獻選擇不同濃度

12、的TGP加入HaCaT細胞，測定HaCaT細胞增殖的改變；
　　 (2)不同濃度TGP孵育HaCaT細胞48h后，測定VEGF和IL-23 mRNA及蛋白的表達；
　　 (3)HaCaT細胞經(jīng)p38 MAPK阻斷劑SB203580預(yù)處理2 h后，給予125mg/LTGP孵育，測定HaCaT細胞VEGF和IL-23 mRNA及蛋白的表達；
　　 (4)125mg/LTGP孵育HaCaT細胞0、5、15、30 min

13、，檢測p38 MAPK磷酸化的改變；
　　 (5)HaCaT細胞經(jīng)p38 MAPK阻斷劑SB203580預(yù)處理2 h后，給予TGP孵育，測定p38 MAPK磷酸化改變。
　　 3.實驗方法
　　 3.1.甲基噻唑基四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法測定HaCaT細胞增殖
　　 將HaCaT細胞分組給予不同濃度TGP干預(yù)，加入5g/L的MTT液20μ l繼續(xù)培養(yǎng)4h，

14、再加入二甲基亞砜150μ l，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標儀490nm處測量各孔吸光值。
　　 3.2.實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-Time RT-PCR)檢測VEGF和IL-23 mRNA的表達
　　 將所收集的細胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，以管家基因GAPDH作為參照，通過real-time RT-PCR技術(shù)檢測VEGF和IL-23 mRNA的表達。
　　 3.3.雙抗體夾心ELISA法檢

15、測VEGF和IL-23蛋白表達
　　 將所收集的細胞培養(yǎng)上清進行孵育、酶反應(yīng)、顯色等步驟，酶標儀450nm處測量各孔吸光值，根據(jù)標準曲線計算出相應(yīng)濃度。
　　 3.4.Western blot檢測p38 MAPK蛋白表達
　　 將所收集的細胞提取總蛋白，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、顯色、凝膠成像分析系統(tǒng)成像、應(yīng)用Qwin圖像分析軟件進行半定量分析，檢測p38 MAPK蛋

16、白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.TGP對HaCaT細胞增殖的影響
　　 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果和細胞生長曲線，統(tǒng)計分析顯示：TGP在低濃度0.5mg/L、2.5 mg/L時對HaCaT細胞的增殖有促進作用(P<0.01)；濃度增高為12.5 mg/L～125 mg/L時反而對細胞的增殖有抑制作用(P<0.01)，且隨TGP濃度的增加抑制作用愈明顯，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義。TGP125mg/L時抑制作用最明顯。

17、
　　 2.TGP對HaCaT細胞表達和分泌VEGF的影響
　　 (1)0.5 mg/LTGP、2.5 mg/LTGP作用于HaCaT細胞48h，VEGF的分泌量和VEGFmRNA的表達量均高于對照組(P<0.05)。12.5 mg/LTGP、62.5mg/LTGP、125 mg/LTGP作用于HaCaT細胞48h，隨藥物濃度的增加，VEGF的分泌量和VEGFmRNA的表達量均低于對照組(P<0.05)。其中TGP濃度為

18、125 mg/L時VEGF分泌量和VEGFmRNA的表達量最低。
　　 (2)p38 MAPK阻斷劑.SB203580對.TGP誘導(dǎo)的HaCaT細胞VEGFmRNA表達和VEGF蛋白分泌的影響
　　 p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理2 h后再給予125 mg/LTGP作用48h，HaCaT細胞分泌VEGF的量和VEGFmRNA的表達量均較單獨125 mg/LTGP作用時明顯增高(P<0.01)。
　　

19、3.TGP對HaCaT細胞表達和分泌IL-23的影響
　　 (1)0.5mg/LTGP、2.5mg/LTGP作用于HaCaT細胞48h，IL-23的分泌量和IL-23mRNA的表達量均高于對照組(P<0.05)。62.5mg/LTGP、125mg/LTGP作用于HaCaT細胞48h，隨藥物濃度的增加，IL-23的分泌量和IL-23mRNA的表達量均低于對照組(P<0.05)。其中TGP濃度為125mg/L時IL-23分泌量和IL

20、-23mRNA的表達量最低。TGP濃度為12.5mg/L時IL-23分泌量和IL-23mRNA的表達量與對照組相比沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (2)p38 MAPK阻斷劑SB203580對TGP誘導(dǎo)的HaCaT細胞IL-23mRNA的表達和IL-23蛋白分泌的影響
　　 p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理2 h后再給予125mg/LTGP作用48h，HaCaT細胞分泌IL-23的量和IL-23mRNA

21、的表達量均較單獨125mg/LTGP作用時明顯增高(P<0.01)。
　　 4.TGP對HaCaT細胞p38磷酸化的影響
　　 4.1 TGP對HaCaT細胞p38 MAPK磷酸化的影響
　　 125mg/LTGP作用于孵育的HaCaT細胞，在不同時間段(5min、10min、30min)收集細胞，p-p38蛋白表達于5min達到高峰，10min后p-p38表達水平逐漸減弱，但與對照組表達水平比較差別仍有統(tǒng)計學意

22、義(P<0.01)；T-p38蛋白表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 4.2 p38 MAPK阻斷劑SB203580對TGP誘導(dǎo)HaCaT細胞p38 MAPK磷酸化的影響
　　 HaCaT細胞經(jīng)p38MAPK阻斷劑SB203580(10μ M)預(yù)處理2 h后，再給予125mg/LTGP孵育5min，結(jié)果經(jīng)SB203580預(yù)處理組p-p38表達水平明顯低于單獨TGP給藥組，兩組相比有統(tǒng)計學意義(P<0