血小板微顆粒影響內(nèi)皮細胞血管內(nèi)皮生長因子表達及機制.pdf

1、目的:
　　 檢測血小板微顆粒(platelet-derived microparticles,PMPs)誘導(dǎo)后的人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達及其傳導(dǎo)通路。研究不同濃度PMPs及與細胞不同作用時間下對內(nèi)皮細胞釋放血管內(nèi)皮生長因子的差異,探討PMPs影響內(nèi)皮細胞VEGF釋放的可能機制及其臨床意義。
　　 方法:
　　 應(yīng)用流

2、式細胞術(shù)(FCM)從貧血小板血漿(PPP)中提取血小板微顆粒(PMPs),特異性熒光抗體CD61-FITC標記PMPs,上機檢測其數(shù)量并應(yīng)用半自動生化分析儀檢測血小板微顆粒中蛋白含量。人臍靜脈內(nèi)皮細胞在37℃、5％CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng),實驗采用3～4代細胞；按1×105/ml密度接種于9.6 cm2的六孔板中,24h后換液,生長接近100％時,即內(nèi)皮細胞約數(shù)為2.5×106時進行PMPs的干預(yù)。應(yīng)用不同干預(yù)濃度的PMPs與人臍靜脈內(nèi)皮

3、細胞共培養(yǎng)不同時間,每一組4個樣本,分別在干預(yù)2小時、4小時、24小時后收集內(nèi)皮細胞,應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)測定內(nèi)皮細胞VEGF、VEGF受體Flt/KDR、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)以及胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,EgK)的表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 應(yīng)用流式細胞術(shù)(FCM)

4、,經(jīng)過二磷酸腺苷(ADP)激活血小板,可以從貧血小板血漿(PPP)中提取并檢測到高純度的血小板微顆粒。不同干預(yù)濃度的PMPs與人臍靜脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)不同時間后,半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)測定mRNA表達,VEGF mRNA的表達水平在對照組(PMPs未干預(yù)組)顯著高于PMPs干預(yù)濃度為10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml組(P<0.05),與之相反,KDR mRNA表達水平在對照組顯著低于四組不同濃度PM

5、Ps組mRNA表達水平(P<0.05)。ERKmRNA表達水平在PMPs50μg/ml組顯著高于對照組(P<0.05),P13KmRNA表達水平在PMPs100μg/ml組顯著高于對照組(P<0.05)。PMPs干預(yù)細胞不同時間,VEGF mRNA的表達水平在對照組顯著高于PMPs干預(yù)24小時組(P<0.05),KDRmRNA的表達水平在對照組顯著低于PMPs干預(yù)4小時、24小時組(P<0.05),PI3KmRNA表達水平在PMPs干預(yù)

6、24小時組顯著高于對照組(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 貧血小板血漿法血小板經(jīng)ADP激活,可使其釋放大量PMPs。PMPs干預(yù)內(nèi)皮細胞后,PMPs被激活,可能釋放大量的VEGF,使得內(nèi)皮細胞自身的VEGFmRNA表達受到負反饋抑制而減少,而內(nèi)皮細胞VEGF受體2即KDRmRNA表達明顯增加,其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的兩個關(guān)鍵酶PDK及ERKmRNA表達也明顯升高,即PMPs可能通過PI3K/Akt及MAPK/ERK等