重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?br>　　 目的:構(gòu)建大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷的動(dòng)物模型，并通過行為學(xué)評(píng)分、組織學(xué)染色等方法對(duì)該模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 方法:清潔級(jí)雌性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組(A組，n=30)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，只行椎板切除術(shù)不作頸脊髓壓迫操作；脊髓亞急性壓迫組(B組，n=30)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，制作頸脊髓亞急性壓迫性損傷的模型。分別在術(shù)后3d，7d，14d，21d，28

2、d時(shí)間點(diǎn)，用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)四肢運(yùn)動(dòng)功能；在兩組中隨機(jī)選取2只大鼠，行脊柱側(cè)位X線檢查，觀察壓迫裝置與脊柱間的相對(duì)位置關(guān)系，壓迫裝置是否松動(dòng)、移位或脫落，并了解頸脊髓受壓迫的程度。將頸脊髓做病理切片，行HE染色，觀察頸髓損傷病變的情況。
　　 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，部分大鼠于術(shù)后24h內(nèi)出現(xiàn)癱瘓，考慮為急性損傷所致，少數(shù)大鼠死亡，舍棄上述兩類，并重新造模補(bǔ)齊。亞急性損傷的大鼠則在7d后逐漸出現(xiàn)癱瘓，其身體僵硬程度輕或軟癱，前爪輕度掌

3、曲，尚能爬動(dòng)和進(jìn)食，膀胱充盈但未失禁或癃閉。大部分模型僅見動(dòng)作遲緩，未出現(xiàn)畸形和異常體位。肢體運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)估結(jié)果示：在3、7d時(shí)間點(diǎn)，兩組間BBB評(píng)分相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；14d，A組和B組評(píng)分相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；21、28d，A組和B組分別評(píng)分相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠脊柱側(cè)位X線示：頸脊髓壓迫裝置在其頸椎內(nèi)固定位置較好，壓迫螺釘正好與脊髓外膜相接觸，進(jìn)而造成頸脊髓壓迫；行大鼠頸椎過伸過屈側(cè)位片，未見脊髓壓迫裝置松動(dòng)及脫落。H

4、E染色結(jié)果可見：低倍鏡下觀察，A組大鼠的頸脊髓表面未見擠壓痕跡，B組大鼠的頸脊髓表面都有不同程度的壓痕，并且受壓處的脊髓組織隨時(shí)間推移逐漸出現(xiàn)液化壞死，瘢痕化。高倍鏡下觀察，A組大鼠的頸脊髓神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，胞膜、核膜染色清晰，胞核位于細(xì)胞中央，大而圓，核染色質(zhì)較少，弱嗜堿性染色呈淡藍(lán)色，核中央核仁顯色清楚，胞漿呈弱酸性染色呈淡紅色，伴有較多突起。B組大鼠的頸脊髓可見神經(jīng)元細(xì)胞腫脹明顯、甚至出現(xiàn)空泡，胞核濃縮深染、核溶解，核固縮，結(jié)構(gòu)

5、消失，血管周圍間隙增寬，神經(jīng)軸索周圍間隙增寬，白質(zhì)呈疏網(wǎng)狀改變；隨頸髓受壓時(shí)間延長(zhǎng)，術(shù)后14、21、28d，鏡下可見胞質(zhì)濃縮、核固縮深染等明顯改變，并伴有神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目的減少及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷的動(dòng)物模型，并對(duì)模型進(jìn)行系統(tǒng)的行為學(xué)評(píng)分及相關(guān)的病理學(xué)檢查，證實(shí)是本實(shí)驗(yàn)的模型為一個(gè)較理想模擬亞急性壓迫性頸脊髓損傷的動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 第二部分促紅細(xì)胞生成素及其受體在大

6、鼠頸脊髓組織中的表達(dá)
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)旨在闡述頸脊髓亞急性壓迫性損傷后EPO及EPO-R的表達(dá)及時(shí)間分布規(guī)律，及rhEPO對(duì)動(dòng)物模型的治療作用。
　　 方法:清潔級(jí)雌性Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為四組：假手術(shù)對(duì)照組(A組，n=5)，只行椎板切除術(shù)不作頸脊髓壓迫操作；生理鹽水對(duì)照組(B組，n=25)：建模術(shù)后7d靜脈推注給予生理鹽水1mL/d安慰治療；小劑量rhEPO治療組(C組，n=25)：建模術(shù)后7d靜脈推注給予

7、500 units/kg b.w.rhEPO治療；大劑量rhEPO治療組(D組，n=25)：建模術(shù)后7d靜脈推注給予5000units/kg b.w.rhEPO治療。在建模手術(shù)后，分別于第3、7、14、21、28d，采用Basso運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分法，進(jìn)行肢體運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)分。BBB評(píng)分為22分制，觀察下肢沒有肌肉收縮或運(yùn)動(dòng)為0分，正常運(yùn)動(dòng)為21分；在動(dòng)物完全清醒狀態(tài)下，通過觀察下肢活動(dòng)和承重能力，對(duì)其肢體肌力進(jìn)行評(píng)估。并于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，處死動(dòng)物

8、，取出損傷節(jié)段頸脊髓，做石蠟切片并進(jìn)行EPO及EPO-R的免疫組化染色。
　　 結(jié)果:肢體運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)分結(jié)果，在3、7d時(shí)間點(diǎn)，各組間BBB評(píng)分相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；14d，C組和D組分別與B組評(píng)分相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，21、28d，C組和D組分別與B組評(píng)分相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，C組和D組評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。A組：正常大鼠頸脊髓內(nèi)EPO陽性細(xì)胞的均數(shù)為10.6±2.5，EPO-R陽性細(xì)胞均數(shù)為8.6±1.2，

9、均數(shù)在隨后的時(shí)間點(diǎn)無明顯改變。B組：損傷后3d，EPO陽性細(xì)胞的均數(shù)為10.2±2.9，EPO-R陽性細(xì)胞均數(shù)為9.5±1.7，與對(duì)照組相比，二者間統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異；手術(shù)后7d，EPO陽性細(xì)胞的均數(shù)為10.7±2.3，EPO-R陽性細(xì)胞均數(shù)為10.8±2.2，與對(duì)照組相比，二者統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異；手術(shù)后14d，EPO陽性細(xì)胞的均數(shù)明顯減少，計(jì)數(shù)為8.2±2.1，與對(duì)照組相比，二者間統(tǒng)計(jì)學(xué)上仍無顯著性差異，另一方面EPO-R陽性細(xì)胞

10、的均數(shù)反應(yīng)性增多，計(jì)數(shù)達(dá)到26.31±6.3，與對(duì)照組相比，二者間統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異，且均數(shù)值很高；手術(shù)后28d，EPO陽性細(xì)胞的均數(shù)為13.8±2.4，EPO-R陽性細(xì)胞均數(shù)為12.6±4.1，與對(duì)照組相比，二者間統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。
　　 結(jié)論:EPO及EPO-R是一種內(nèi)源性的神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)，可能在神經(jīng)損傷修復(fù)過程中具有重要的作用，脊髓損傷后EPO-R反應(yīng)性增多，為外源性EPO提供靶點(diǎn)。頸脊髓亞急性壓迫性損傷后給予rhE

11、PO可取的良好的臨床治療效果。
　　 第三部分 rhEPO對(duì)大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)研究不同劑量的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對(duì)大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。
　　 方法:清潔級(jí)雌性Wistar大鼠80只，假手術(shù)對(duì)照組(A組，n=5)，只行椎板切除術(shù)不作頸脊髓壓迫操作；生理鹽水對(duì)照組(B組，n=25)：建模術(shù)后7d靜脈推注給予生理鹽水1mL/d安慰

12、治療；小劑量rhEPO治療組(C組，n=25)：建模術(shù)后7d靜脈推注給予500 units/kg b.w.rhEPO治療；大劑量rhEPO治療組(D組，n=25)：建模術(shù)后7d靜脈推注給予5000units/kg b.w.rhEPO治療。手術(shù)后分別于3、7、14、21、28d各時(shí)間點(diǎn)處死模型，取損傷的頸脊髓標(biāo)本進(jìn)行原位末端標(biāo)記法(TUNEL)染色和流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:TUNEL標(biāo)記陽性的細(xì)胞核被染成棕褐

13、色，胞漿復(fù)染為淡藍(lán)色。B組，7d，TUNEL染色陽性的細(xì)胞很少見；14d，在壓迫部位灰質(zhì)中觀察到陽性細(xì)胞，包括頸髓前后角神經(jīng)元；21d，壓迫節(jié)段的脊髓灰質(zhì)發(fā)現(xiàn)大量的TUNEL陽性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞，并且伴有一些形態(tài)不確定的陽性小細(xì)胞；28d時(shí)仍有大量的陽性細(xì)胞，同21d相比數(shù)量沒有明顯差異。在C、D組，7、14d，脊髓僅發(fā)現(xiàn)很少的TUNEL陽性細(xì)胞；21d，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)量較B組明顯減少，且在28d在脊髓白質(zhì)中甚至在脊髓后柱僅有很少T

14、UNEL陽性的細(xì)胞。B組凋亡細(xì)胞數(shù)量從14d開始明顯增加，在21d凋亡細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，并維持至28d仍有較多凋亡細(xì)胞數(shù)量。同C、D組相比，7d時(shí)，各組細(xì)胞數(shù)量沒有明顯差異；21d時(shí)，C組和D組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量同B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:rhEPO通過抑制亞急性壓迫性頸脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡而起到神經(jīng)保護(hù)作用，這為rhEPO用于亞急性頸脊髓壓迫性損傷的治療提供了理論依據(jù)，為臨床治療亞急性頸脊髓損傷提供了新的措施和思路

15、。
　　 第四部分 rhEPO對(duì)大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷后炎性因子表達(dá)的作用
　　 目的:本試驗(yàn)研究不同劑量的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對(duì)亞急性頸脊髓壓迫性損傷細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，旨在探討其對(duì)頸髓繼發(fā)性損傷作用的機(jī)制。
　　 方法:清潔級(jí)雌性Wistar大鼠80只，假手術(shù)對(duì)照組(A組，n=5)，只行椎板切除術(shù)不作頸脊髓壓迫操作；生理鹽水對(duì)照組(B組，n=25)：建模術(shù)后7d靜脈推注給予生理鹽水1mL

16、/d安慰治療；小劑量rhEPO治療組(C組，n=25)：建模術(shù)后7d靜脈推注給予500 units/kg b.w.rhEPO治療；大劑量rhEPO治療組(D組，n=25)：建模術(shù)后7d靜脈推注給予5000units/kg b.w.rhEPO治療。手術(shù)后分別于3、7、14、21、28d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死模型，取損傷的頸脊髓標(biāo)本，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)定量檢測(cè)IL-8，TNF-a，IL-6和IL-1β的含量。
　　 結(jié)果:E

17、LISA結(jié)果：IL-8檢測(cè)示，術(shù)后3d，B、C、D組表達(dá)到達(dá)峰值，B組術(shù)后28d持續(xù)高表達(dá)；C，D組在術(shù)后21d表達(dá)顯著降低，尤其以D組降低為著；術(shù)后28d，C，D組表達(dá)顯著降低，同B組相比均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α結(jié)果示，術(shù)后第7d，B、C、D組表達(dá)到達(dá)峰值，B組術(shù)后28d表達(dá)持續(xù)降低，C，D組在術(shù)后14d表達(dá)顯著降低，術(shù)后28d，C，D組表達(dá)較21d時(shí)無顯著變化，同對(duì)照組相比均具有顯著意義。IL-6檢測(cè)示，術(shù)后第7d，B、C、

18、D組表達(dá)到達(dá)峰值，隨后各組表達(dá)顯著降低，D組在術(shù)后21d表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，但是C組降低不明顯。術(shù)后28d，C，D組表達(dá)無明顯變化。IL-1β結(jié)果示，術(shù)后第3d，B、C、D組表達(dá)到達(dá)峰值，B組術(shù)后14d開始表達(dá)降低，C，D組在術(shù)后第7d開始表達(dá)顯著降低。術(shù)后21、28d，B、C、D組表達(dá)量無明顯差異。
　　 結(jié)論:頸脊髓亞急性壓迫性損傷后給予rhEPO能抑制多種細(xì)胞因子及趨化因子生成及表達(dá)，減輕損傷后炎癥反應(yīng)，EPO在炎癥反應(yīng)