重組人紅細(xì)胞生成素治療大鼠急性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的： 急性脊髓損傷(Actlte spinal cord injury，ASCI)仍然是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)疾病。現(xiàn)代社會(huì)的交通運(yùn)輸業(yè)、建筑業(yè)、體育運(yùn)動(dòng)等發(fā)展迅速，因此而導(dǎo)致的急性脊髓損傷病例也隨之增多。僅美國(guó)每年新發(fā)脊髓損傷病例就有大約11000例，每百萬(wàn)人口里有40例。據(jù)估計(jì)我國(guó)每年約有50000人發(fā)病，呈10﹪的上升趨勢(shì)。脊髓損傷一旦發(fā)生，視傷時(shí)輕重不同，將導(dǎo)致患者不同程度的肢體殘疾。除了給患者本身帶來(lái)巨大的

2、痛苦，加重社會(huì)及康復(fù)機(jī)構(gòu)人力、物力及財(cái)力的負(fù)擔(dān)，脊髓損傷還增加了患者、家庭以及朋友的心理負(fù)擔(dān)。 急性脊髓損傷至今仍缺乏行之有效的治療措施。ASCI的治療仍然是醫(yī)學(xué)研究的一大難題。新千年的第一個(gè)十年(2001-2010)被稱為“脊柱十年”，目的在于深化我們對(duì)于脊柱疾病，包括脊髓損傷，的認(rèn)識(shí)并提高治療效果。在眾多治療措施中，藥物治療仍然是目前ASCI的研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)引起了

3、國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。 長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為EPO作為一種激素，僅僅作用于紅骨髓，促進(jìn)紅系造血祖細(xì)胞增殖、分化。重組人紅細(xì)胞生成素(Recombinant human erythropoietin，rHlJEPO)被廣泛應(yīng)用于治療腎功能衰竭、HIV感染、癌癥和外科手術(shù)等引起的貧血。但近十余年的報(bào)道提示，EPO是多效應(yīng)的細(xì)胞因子，對(duì)多種組織起到保護(hù)作用，如心肌細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎臟管狀上皮細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central

4、nervous system，CNS)等。 EPO的神經(jīng)保護(hù)功效已經(jīng)在多種動(dòng)物的多種CNS疾病模型中得到驗(yàn)證。如腦缺血模型、蛛網(wǎng)膜下腔血腫模型、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型及脊髓損傷模型等。其中，EPO用于脊髓損傷的研究相對(duì)較少，多集中于近4-5年，且給藥時(shí)間多為損傷后短時(shí)間內(nèi)給藥。而Rrines等認(rèn)為rHuEPO在腦缺血的治療上存在時(shí)間窗。我們認(rèn)為rHuEPO在用于ASCI也同樣存在一定的時(shí)間窗。本課題擬分兩部分研究rHuEP

5、O對(duì)大鼠急性脊髓損傷后的神經(jīng)功能保護(hù)作用。 第一部分：在大鼠脊髓損傷后分不同時(shí)間給予一定量rHuEPO，通過(guò)觀察脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況及BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分，以此對(duì)于rHuEPO治療ASCI的時(shí)間窗進(jìn)行初步的研究。為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究rHuEPO的時(shí)間窗提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)方法。 第二部分：根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取最佳給藥時(shí)間，給予一定量rHuEPO，通過(guò)行為學(xué)觀察和組織病理學(xué)觀察指標(biāo)來(lái)研究rHuEPO治療大鼠急性

6、脊髓損傷的長(zhǎng)期效果。 第一部分大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間注射重組人紅細(xì)胞生成素對(duì)運(yùn)動(dòng)功能及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響研究方法40只雌性大鼠脊髓血管夾夾傷模型(aneurysm clip model)成功后，隨機(jī)均分為5組，每組8只。A組(即刻給藥組)：大鼠脊髓損傷(SCI)后立即腹腔注射rHuEPO(5000IU/Kg/Bw)；B組(1小時(shí)給藥組)；C組(3小時(shí)給藥組)；D組(6小時(shí)給藥組)；E組(對(duì)照組)：SCI后立即腹腔注射等量生理鹽水

7、。各組大鼠術(shù)后第1、3、5、7d進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)分。選取術(shù)后第3天和第7天為取材時(shí)問(wèn)點(diǎn)，各組每時(shí)間點(diǎn)各取4只。行TUNEL染色和caspase-3免疫組化染色，觀察各組在術(shù)后第3天和第7天脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。 結(jié)果 總體上EPO各給藥組的BBB評(píng)分較對(duì)照組高。但不同給藥組之間出現(xiàn)了一定差異。第3天6h給藥組的BBB評(píng)分和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 而第7天的時(shí)候，雖然6h給藥組的評(píng)分高于對(duì)

8、照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但是與即刻給藥組、1h給藥組和3h給藥組相比，6h給藥組的評(píng)分較低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 TUNEL染色結(jié)果顯示在傷后第3天和第7天這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，給藥的四組凋亡細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組為少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但在傷后第3天，可以看出6h給藥組凋亡細(xì)胞數(shù)比1h給藥組的多，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在傷后第7天，立即給藥組、1h給藥組和3h給藥組的凋亡細(xì)胞數(shù)比6h

9、給藥組的少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中立即給藥組和3h給藥組的凋亡細(xì)胞數(shù)比6h給藥組的少，差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Caspase-3免疫組合染色結(jié)果顯示各治療組均較對(duì)照組的凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率為低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F<0.01)。但在傷后第3天，6h給藥組的凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率較即刻給藥組、1h給藥組和3h給藥組的高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，6h給藥組的凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率與即刻給藥組和3h給藥組的差異

10、存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論 1．rHuEPO具有神經(jīng)功能保護(hù)功效。可以改善大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，并抑制傷后脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。 2．大鼠急性脊髓損傷后3h內(nèi)給予rHuEPO可顯著改善其后肢運(yùn)動(dòng)功能并抑制細(xì)胞凋亡。而延遲到傷后6h給予rHuEPO，收效甚微。 第二部分重組人紅細(xì)胞生成素治療大鼠急性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究研究方法50只雌性大鼠脊髓血管夾夾傷模型成功后，隨機(jī)分至3組

11、：rHuEPO組，20只；生理鹽水組，20只；假手術(shù)組，10只。通過(guò)BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分觀察各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況；組織病理學(xué)選擇HE和抗GFAP、Nogo-A和NelJN免疫組化染色的方法評(píng)價(jià)rHuEPO對(duì)于ASCI的保護(hù)及修復(fù)作用。 結(jié)果 術(shù)后第1周開(kāi)始各觀察點(diǎn)上rHuEPO組的BBB評(píng)分即高于生理鹽水組(P(0.01)。 生理鹽水組GFAP的陽(yáng)性面積明顯高于rHuEPO組，且各觀察點(diǎn)的差異均存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、意義(P(0.01)。而rHuEPO組和假手術(shù)組相比，雖然各觀察點(diǎn)前者均值均較高，但除了在第6周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.01)，其余觀察點(diǎn)兩者差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 各觀察點(diǎn)上，rHuEPO組的Nogo-A表達(dá)光密度均低于生理鹽水組，且差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.01)。 各觀察點(diǎn)上，生理鹽水組NeuN染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯少于rHuEPO組，差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.01)。 結(jié)論