siRNA沉默Wip1基因?qū)θ四懝馨㏎BC939細(xì)胞的影響.pdf

1、背景和目的:膽管癌(Cholangiocarcinoma, CCA)是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性程度極高的消化道腫瘤，在人類消化道惡性腫瘤總病例中約占2％～3％左右。1840年Durand Fardel首次報(bào)道膽管癌，是肝臟和膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中較為常見的一種，約占肝膽系腫瘤的10％～15％。膽管癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為1.2/10萬，但近十年內(nèi)膽管癌發(fā)病率趨勢呈現(xiàn)為逐年升高，在我國其發(fā)病率上升速度是每年遞增5％，是上升速度最快的消化

2、道腫瘤。由于膽管癌特殊的解剖位置及其向周圍組織、血管、神經(jīng)浸潤的特殊的病理特征，且膽管癌患者缺乏早期特異性的臨床表現(xiàn)和有效的診斷手段，以至于很多病人就診時(shí)多數(shù)已處于癌癥的中晚期，即已發(fā)生微轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。盡管近年來外科手術(shù)、化療、放療等治療手段在膽管癌治療中取得了較大的進(jìn)步，但其仍是難以達(dá)到腫瘤根治的效果。切除率低，對(duì)常規(guī)放化療手段不敏感，病死率高是膽管癌目前治療的現(xiàn)狀，世界范圍內(nèi)膽管癌術(shù)后患者3年生存率僅為35％至50％，

3、5年生存率不到10％，而我國膽管癌術(shù)后5年生存率僅為5％左右?，F(xiàn)膽管癌治療是以手術(shù)切除為首選的外科綜合治療，但僅手術(shù)切除無法達(dá)到根治的效果，而且很多完成手術(shù)的病人在術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)，這些均嚴(yán)重制約手術(shù)效果和病人預(yù)后。因此，研究膽管癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，了解膽管癌進(jìn)展過程中可能的分子步驟，找尋臨床膽管癌病人的治療、預(yù)后分析和適宜靶點(diǎn)十分必要。
　　野生型p53誘導(dǎo)的蛋白磷酸酶1(wild type p53 induced pr

4、otein phosphatases，Wip1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種絲/蘇氨酸酶活性的蛋白磷酸酶，為原癌基因的一種，位于人染色體17q22/q24區(qū)域，它在多種腫瘤中存在高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤生長，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)。但尚未有關(guān)于Wip1基因在人膽管癌細(xì)胞中表達(dá)的研究。
　　RNA干擾（RNA interference，RNAi）是生物界普遍存在的一種抵御外來基因和病毒感染的保守進(jìn)化機(jī)制，是一種轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的研究方法。其作用機(jī)制是

5、細(xì)胞內(nèi)mRNA與siRNA特異結(jié)合、由RISC介導(dǎo)使靶向結(jié)合mRNA的降解，阻止其翻譯作用，從而導(dǎo)致基因沉默，具有極高的有效性和靶向性，是在mRNA水平上引起基因沉默的機(jī)制。因RNA干擾具有快速、高效、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因功能鑒定等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。
　　本研究設(shè)計(jì)并合成能沉默Wip1基因表達(dá)的siRNA，轉(zhuǎn)染到人膽管癌QBC939細(xì)胞株，檢測轉(zhuǎn)染后其對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　

6、方法:設(shè)計(jì)并合成能使Wip1基因沉默的siRNA，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)并轉(zhuǎn)染人膽管癌QBC939細(xì)胞，該實(shí)驗(yàn)分為siRNA轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。用Western blot和qRT-PCR分別檢測siRNA轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組膽管癌QBC939細(xì)胞中Wip1基因的蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平，用CCK-8法檢測siRNA轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組膽管癌QBC939細(xì)胞增殖的變化，用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測siRNA轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組膽管癌QBC939細(xì)胞遷移能力的改

7、變，用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測siRNA轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組膽管癌QBC939侵襲、遷移能力的改變。應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異非常顯著。
　　結(jié)果:將沉默Wip1基因的siRNA轉(zhuǎn)染入膽管癌QBC939細(xì)胞后，與空白對(duì)照組相比，Wip1的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05); CCK-8檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后第三天細(xì)胞增殖能力較空白對(duì)照組降低