重組人FHIT真核表達質粒的構建及其干預膽管癌細胞株QBC939增殖、凋亡及侵襲性的研究.pdf

1、序言：真核表達質粒的構建和轉染是目前醫(yī)學研究中常用的分子生物學手段。而腫瘤的發(fā)生與抑癌基因和癌基因密切相關。FHIT是一種重要的抑癌基因，在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)表達缺失。Cyclin D1為常見的癌基因，它可以促使腫瘤細胞度過細胞周期的限制點，如G1/S限制點。它們的相互調控作用，尤其是FHIT干預膽管癌細胞的增殖、凋亡及侵襲性成為本次研究的重點。
　　 目的：通過構建重組人脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因真核表達質粒，探討FHIT

2、基因對膽管癌細胞株QBC939增殖、凋亡及侵襲性的影響，并進一步研究FHIT基因對細胞周期蛋白Cyclin D1的調控作用。
　　 方法：首先通過Trizol法提取新鮮標本組織中的RNA進行RT-PCR，將產物與載體pcDNA 3.1用BamH I/Xho I雙酶切純化后相連接，構建出重組真核表達質粒，并進行序列鑒定。然后通過脂質體瞬時轉染法，將構建的FHIT-pcDNA 3.1轉染入QBC939細胞，挑選出新霉素抗性克隆并進行

3、熒光定量RT-PCR鑒定。將實驗對象隨機分為三組：自然對照組(NCG)、空白對照組(BCG)和實驗組(EPG)。分別使用MTT法檢測細胞增殖情況、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況、Transwell小室侵襲實驗檢測侵襲能力的變化、熒光定量RT-PCR檢測Cyclin D1 mRNA表達情況及Western Blot法檢測Cyclin D1蛋白質表達情況。所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。
　　 結果：構建出了重組人FHIT真核表達質粒并經(jīng)過

4、序列鑒定。熒光定量RT-PCR檢測轉染后的QBC939細胞FHIT基因表達有限恢復。實驗組與兩個對照組比較，QBC939細胞增殖被抑制(P<0.05)，促進了其凋亡，傳過小室膜的細胞數(shù)量明顯減少；并且Cyclin D1在基因和蛋白質水平的表達均被下調(P<0.05)。
　　 結論：成功構建了重組人FHIT真核表達質粒。FHIT基因可以干預QBC939細胞的增殖和凋亡，減弱其侵襲力，并能下調Cyclin D1的表達水平。為膽管癌進