紫杉醇誘導(dǎo)人膽管癌QBC939細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、膽管癌臨床上起病隱匿，出現(xiàn)癥狀較晚，早期診斷困難，手術(shù)切除率較低，加之缺乏有效和敏感的化療藥物，預(yù)后較差。腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞分化異常的結(jié)果，同時(shí)也與腫瘤細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)，針對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡失衡對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行干預(yù)性調(diào)節(jié)就不失為一種腫瘤治療策略。紫杉醇以其獨(dú)特的藥理作用成為熱點(diǎn)抗癌新藥，得到廣泛應(yīng)用。但紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。 隨著雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，使蛋白質(zhì)組分析

2、及其在臨床疾病中的應(yīng)用成為重要的研究方法。本研究從細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、體外藥物誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡、觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞流式儀分析細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析蛋白表達(dá)譜的差異技術(shù)路線，研究化療藥物紫杉醇對(duì)膽管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制，旨在為研究膽管癌的發(fā)病機(jī)制、闡明抗癌藥物對(duì)膽管癌新的作用靶點(diǎn)，為指導(dǎo)臨床用藥提供基礎(chǔ)理論平臺(tái)。 第一章紫杉醇對(duì)膽管癌細(xì)胞株QBC939作用敏感性的體外測(cè)定 目的：探討紫杉醇對(duì)膽管癌細(xì)

3、胞作用的敏感性，為膽管癌的臨床治療尋找新的治療藥物。方法：體外培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞QBC939，采用不同濃度紫杉醇予以干預(yù)，通過細(xì)胞形態(tài)觀察和MTT實(shí)驗(yàn)，初步研究人紫杉醇對(duì)人膽管癌細(xì)胞QBC939的敏感性。結(jié)果：各濃度紫杉醇對(duì)抑制人膽管癌細(xì)胞QBC939生長均有明顯的抑制，具有時(shí)間一濃度依賴性。各濃度紫杉醇對(duì)QBC939N胞藥物干預(yù)組和未干預(yù)組(陰性對(duì)照組)的抑制作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。MTT法測(cè)得結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫杉醇對(duì)QBC93

4、9最大抑制率為67.02％，中效濃度為0.46μmol/L。結(jié)論：紫杉醇能抑制人膽管癌細(xì)胞QBC939的增殖，且抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)。 第二章紫杉醇誘導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 目的：研究紫杉醇對(duì)膽管癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的影響，探討紫杉醇誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡的機(jī)制。方法：應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)紫杉醇誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)對(duì)細(xì)胞周期的變化和動(dòng)力學(xué)予以檢測(cè)。結(jié)果：流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組：G0/G

5、1期占11.27％、S期51.17％、G2／M期33.82％、Sub-G1(apoptosis)3.74％。G0／G1期明顯減少，并出現(xiàn)亞二倍體峰，對(duì)照組：G0／G1期62.28％、S期17.49％、G2／M期8.16％、Sub-G1(apoptosis)12.07％，未見出現(xiàn)亞二倍體峰。結(jié)論：紫杉醇能誘導(dǎo)人膽管癌QBC9392胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞被明顯阻滯在S期及G2／M期，且抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)。 第三章2-DE技術(shù)分離

6、膽管癌細(xì)胞凋亡的差異表達(dá)蛋白 目的：篩選紫杉醇誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白，尋找抗膽管癌藥物作用的新靶點(diǎn)。方法：應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)這一技術(shù)中的雙向凝膠電泳技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助圖像分析方法對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)凋亡的膽管癌QBC939細(xì)胞進(jìn)行蛋白分離和蛋白表達(dá)譜差異分析，篩選并鑒定誘導(dǎo)QBC939細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白。結(jié)果：本研究通過雙向凝膠電泳分離測(cè)得干預(yù)組蛋白表達(dá)平均每張蛋白斑點(diǎn)數(shù)為(1081±29)個(gè)，對(duì)照組平均蛋白斑點(diǎn)數(shù)為(1179±36

7、)個(gè)。蛋白質(zhì)點(diǎn)位置在等電聚焦(IEF)方向上其平均偏差為(2.46±0.24)mm，SDS-PAGE電泳垂直方向上的平均位置偏差為(2.65±0.22)mm，表明蛋白質(zhì)點(diǎn)在雙向電泳具有較好的重復(fù)性。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蛋白點(diǎn)匹配率分別為(90.1±0.14)％和(87.1±0.22)％(p<0.05)。匹配后在紫杉醇干預(yù)組中共發(fā)現(xiàn)68個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中47個(gè)表達(dá)下調(diào)和21個(gè)上調(diào)。結(jié)論：應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析所獲得的68個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)可能在

8、QBC939細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中發(fā)揮重要作用。 第四章差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析 目的：鑒定差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，篩選膽管癌新的腫瘤標(biāo)志物，為膽管癌的早期診斷、療效觀察提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。方法：MALDI-TO-F-MS質(zhì)譜測(cè)定其膠內(nèi)酶解后的肽指紋圖譜(PMF)。結(jié)果：MALDI-TOF-MS，獲得28張PMF，在限制相應(yīng)的查詢條件下應(yīng)用Mascot軟件搜索SWISS-PROT／TREMBL數(shù)據(jù)庫，初步質(zhì)譜鑒定鑒定發(fā)

9、現(xiàn)11個(gè)與凋亡相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，其中Gankyrin、CDC27Hs、LaminBl、p16INK4A、p21、Noxa蛋白表達(dá)上調(diào)，Glyceraldehyde 3-phosphate dehyrogenase、Peroxredoxin2、NucleolarphosphoproteinB 23、Antioxidant protein 2蛋白表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：被鑒定出的11個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的差異蛋白點(diǎn)提示紫杉醇是通過多個(gè)重要蛋白，發(fā)揮其