廣東登革2型及4型病毒致病性研究及毒力位點(diǎn)分析.pdf

1、登革熱是登革病毒引起的、世界上最重要的蟲(chóng)媒傳染病之一，根據(jù)臨床癥狀分為普通登革熱與重癥登革熱。近30年，登革熱疫情迅速擴(kuò)大，重癥病例顯著增加，雖然重癥登革熱的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但病毒毒力被普遍認(rèn)為是重要的致病因素之一。廣東省位于亞熱帶，氣候潮濕，伊蚊密度高，是我國(guó)登革熱的高發(fā)地區(qū)，發(fā)生過(guò)登革4種血清型病毒的流行。近年來(lái)，登革熱疫情在該地區(qū)呈快速上升趨勢(shì)。由于對(duì)廣東地區(qū)登革病毒流行株的致病性知之甚少，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)登革熱疫情的有效預(yù)防

2、與控制。因此，深入了解廣東地區(qū)登革病毒流行株的致病性，并通過(guò)毒力位點(diǎn)分析，從基因水平初步闡述該地區(qū)登革病毒的毒力變化規(guī)律，對(duì)于指導(dǎo)我國(guó)登革熱疫情的科學(xué)防控具有重要意義，也為登革病毒的毒力研究提供依據(jù)。
　　一、目的：
　　研究廣東地區(qū)登革2型及4型病毒的致病性，分析可能導(dǎo)致毒力差異的關(guān)鍵位點(diǎn)，初步闡明廣東地區(qū)近年來(lái)登革2型及4型病毒分離株在關(guān)鍵毒力位點(diǎn)上的差異，為我國(guó)登革熱疫情的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。
　　二、方法：<

3、br>　　1、DENV-2-GZ40、DENV-4-GZ30的致病性研究：
　　1）研究對(duì)象：對(duì)廣東2010年登革2型病毒流行株-廣州40株（DENV-2-GZ40）及廣東2010年登革4型病毒流行株-廣州30株（DENV-4-GZ30）的致病性進(jìn)行研究，并分別與1987年登革2型病毒廣西43株（DENV-2-GX43）及1990年登革4型病毒廣州 B5株（DENV-4-GZB5）對(duì)比分析。
　　2） DENV-2-GZ40

4、、 DENV-4-GZ30對(duì) C6/36細(xì)胞的致病性：分別將DENV-2-GZ40、DENV-2-GX43、DENV-4-GZ30、DENV-4-GZB5接種 C6/36細(xì)胞，初步觀察細(xì)胞病變，并繪制病毒在 C6/36細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線；
　　3）DENV-2-GZ40、DENV-4-GZ30對(duì) BHK-21細(xì)胞的致病性：分別將DENV-2-GZ40、DENV-2-GX43、DENV-4-GZ30、DENV-4-GZB5接種 BHK

5、-21細(xì)胞，初步觀察細(xì)胞病變，進(jìn)一步采用噬斑實(shí)驗(yàn)觀察病毒在 BHK-21細(xì)胞上的噬斑大小及形態(tài)，繪制病毒在 BHK-21細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線。為了明確 DENV-2-GZ40對(duì) BHK-21細(xì)胞的感染性，采用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR方法測(cè)定感染細(xì)胞上清液中病毒量及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原；
　　4）DENV-2-GZ40、DENV-4-GZ30對(duì)乳鼠的神經(jīng)毒力：采用腦內(nèi)注射途徑感染昆明乳鼠，觀察乳鼠發(fā)病、死亡情況，計(jì)算其

6、對(duì)乳鼠的 LD50。
　　2、毒力位點(diǎn)分析：
　　1）分別比對(duì) DENV-2-GZ40與 DENV-2-GX43、 DENV-4-GZ30與DENV-4-GZB5全基因序列，分析可能導(dǎo)致毒力差異的位點(diǎn)；
　　2）在 GenBank上搜索廣東地區(qū)近年來(lái)登革2型、4型分離株的全基因序列，比對(duì)其在關(guān)鍵毒力位點(diǎn)的差異，推測(cè)差異可能導(dǎo)致的毒力變化。
　　三、結(jié)果：
　　1、登革2型病毒 GZ40的致病性：
　　

7、在 C6/36細(xì)胞上，DENV-2-GZ40與 DENV-2-GX43均于接種3天后出現(xiàn)典型細(xì)胞病變，但 DENV-2-GZ40復(fù)制滴度稍低于 DENV-2-GX43。在 BHK-21細(xì)胞上，兩毒株也于接種3天后出現(xiàn)細(xì)胞病變，DENV-2-GX43能形成清晰噬斑，直徑0.44mm，DENV-2-GZ40不能形成噬斑；雖然感染 DENV-2-GZ40的 BHK-21細(xì)胞上清液及細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)出病毒且病毒量隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但DENV

8、-2-GZ40在 BHK-21細(xì)胞的復(fù)制水平明顯低于 DENV-2-GX43。腦內(nèi)注射DENV-2-GZ40病毒組乳鼠發(fā)病時(shí)間較腦內(nèi)注射 DENV-2-GX43病毒組延遲，發(fā)病率低，其 LD50為606PFU，DENV-2-GX43對(duì)乳鼠 LD50為0.67PFU。
　　2、登革2型病毒的基因組差異及毒力位點(diǎn)分析：
　　DENV-2-GZ40與 DENV-2-GX43在5’UTR有5個(gè)核苷酸差異，3’UTR有16個(gè)核苷酸差異

9、，編碼區(qū)有80個(gè)氨基酸差異，其中37個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了電荷或疏水性的改變。毒力位點(diǎn) E52、E71、E126及可能的毒力位點(diǎn)5’UTR-78、NS2A-139、NS4B-108、E116、E149、E184差異可能是導(dǎo)致 DENV-2-GZ40毒力減弱的原因。2001-2013年廣東地區(qū)在 GenBank上有7株登革2型病毒全基因序列，在 E193、E203、NS1-164毒力位點(diǎn)有差異。
　　3、登革4型病毒 GZ30的致病性：

10、>　　在 C6/36細(xì)胞上，DENV-4-GZB5于接種7天后出現(xiàn)細(xì)胞病變，DENV-4-GZ30接種細(xì)胞后未觀察到典型病變，兩毒株在 C6/36細(xì)胞上的復(fù)制水平相似。在BHK-21細(xì)胞上，兩毒株均于接種2天后出現(xiàn)相似細(xì)胞病變，均能在 BHK-21細(xì)胞上形成噬斑，DENV-4-GZ30噬斑清晰，平均直徑為0.35mm，DENV-4-GZB5噬斑彌散，平均直徑為0.48mm，兩者在 BHK-21細(xì)胞上復(fù)制水平相似。腦內(nèi)注射 DENV-4-

11、GZ30病毒組乳鼠發(fā)病時(shí)間較腦內(nèi)注射 DENV-4-GZB5病毒組延遲，發(fā)病率低，其 LD50為297PFU，DENV-4-GZB5對(duì)乳鼠 LD50為0.35PFU。
　　4、登革4型病毒的基因組差異及毒力位點(diǎn)分析：
　　DENV-4-GZ30與 DENV-4-GZB5在5’UTR有4個(gè)核苷酸差異，3’UTR有13個(gè)核苷酸不同及 DENV-4-GZ30有一段長(zhǎng)13nt（10289-10302）的缺失，編碼區(qū)有94個(gè)氨基酸差異

12、，其中37個(gè)發(fā)生了電荷或疏水性改變。毒力位點(diǎn) E120、NS5-201及 E46、E147、E221、E265差異可能與 DENV-4-GZ30減毒相關(guān)。1978-2013年廣東地區(qū)在 GenBank上有6株登革4型病毒全基因序列，在 prM127、E155、NS5-201及 NS5-879毒力位點(diǎn)有差異。
　　四、結(jié)論：
　　1、DENV-2-GZ40株對(duì) C6/36、BHK-21細(xì)胞系及乳鼠致病力弱，與其基因組部分位點(diǎn)變