sPLA2在神經炎癥反應中的作用及其機制.pdf

1、研究背景:
　　多種中樞神經系統(tǒng)功能障礙，比如腦感染，腦缺血，腦外傷，中風以及中樞神經系統(tǒng)退行性病變都涉及神經炎癥反應。中樞神經系統(tǒng)炎癥過程的一個重要特點就是促炎介質的生成和釋放，花生四烯酸(AA)是其中的一類重要的促炎介質?；ㄉ南┧岽x途徑最重要的酶促過程就是磷脂酶A2(PLA2)的水解。在病理條件下，PLA2將膜磷脂從Sn-2位脂?；鈹嗔眩尫懦龌ㄉ南┧?，AA經代謝途徑下游的兩種關鍵酶，環(huán)氧酶(COX)和脂氧酶(LOX

2、)催化為前列腺素(PG)和白細胞三烯(LT)等類花生酸代謝產物，損傷腦細胞。PLA2是一類磷脂水解酶超家族，分布最廣泛的兩種亞型是胞質磷脂酶A2(cPLA2)和分泌型磷脂酶A2(sPLA2)。目前對于脂多糖(LPS)誘導的神經炎癥過程中sPLA2的功能還不明了。乙酰葛根素是將葛根素經過結構改良獲得的一種新型異黃酮類化合物，盡管我們已有的報道提示乙酰葛根素對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，但其保護作用機制尚不清楚。
　　研究目的

3、:
　　研究sPLA2在LPS刺激所致大鼠大腦皮層炎癥以及星形膠質細胞炎癥反應中的作用。重點研究了新型異黃酮類化合物乙酰葛根素的神經保護作用，并探討其發(fā)揮神經保護作用的可能機制，為其發(fā)展為治療神經炎癥的具有自主知識產權的創(chuàng)新藥物提供理論基礎。
　　研究方法:
　　本研究由兩部分組成:
　　1.利用原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質細胞來研究sPLA2-ⅡA在LPS誘導的神經炎癥中的作用。采用RT-PCR來檢測在原代培養(yǎng)大鼠星

4、形膠質細胞和小膠質細胞中sPLA2-ⅡAmRNA的表達。以ELISA檢測星形膠質細胞中PGE2濃度。Westernblot檢測AA代謝相關蛋白的表達。體內試驗采用小鼠腦室注射LPS建立腦炎癥損傷模型來研究sPLA2-ⅡA對小鼠大腦皮質炎癥過程中MAPK-cPLA2α-PGE2通路的調節(jié)作用。采用ELISA來檢測小鼠大腦皮質PGE2生成水平。Westernblot來檢測sPLA2-ⅡA，COX-2和mPGES-1蛋白表達水平以及ERK1/

5、2，p38和cPLA2α的磷酸化水平。
　　2.采用高效液相色譜法(HPLC)，對乙酰葛根素在大鼠體內的藥動學過程進行了分析，同時利用原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質細胞模擬體外炎癥模型研究乙酰葛根素在LPS誘導類花生酸合成過程中的作用機制。MTT法檢測乙酰葛根素對原代培養(yǎng)大鼠星形膠質細胞存活率的影響。以western blot及免疫熒光染色檢測各蛋白表達水平，檢測乙酰葛根素是否可以抑制group(Ⅴ)sPLA2的蛋白水平以及阻斷LPS所致

6、ERK1/2/cPLA2α信號通路的激活。采用ELISA來檢測細胞中PGE2和LTC4的釋放量。花生四烯酸代謝途徑的其他相關蛋白表達水平用western blot來檢測。
　　研究結果:
　　1.LPS能夠引起原代培養(yǎng)的星形膠質細胞中sPLA2-ⅡAmRNA表達水平呈時間和劑量依賴性的增加;但在原代培養(yǎng)的小膠質細胞中沒有這一現(xiàn)象。因此我們利用原代培養(yǎng)的星形膠質細胞來模擬體外炎癥條件，來研究sPLA2-ⅡA在LPS誘導PGE2

7、生物合成過程中的作用。在此實驗中我們還引入了sPLA2ⅡA特異性阻斷劑SC-215，在星形膠質細胞中SC-215能夠劑量依賴性的降低LPS誘導產生的PGE2水平。體內試驗部分:腦室注射LPS時采用SC-215干預，可以使sPLA2-ⅡA的蛋白表達下降90％以上。與預期一致，PGE2的合成也在SC-215的干預下被明顯抑制（下降75％以上）。在小鼠大腦皮質中，LPS能夠引起時間依賴性的cPLA2α的磷酸化，ERK1/2的磷酸化要先于cPL

8、A2α，并且在10min時便達到高峰。后續(xù)的磷酸化在30min時仍能檢測到，在60min時回到基礎水平。后續(xù)的實驗結果顯示，sPLA2-ⅡA缺失能使小鼠大腦皮質cPLA2α和ERK1/2的磷酸化水平被明顯抑制，但對p38的磷酸化沒有任何作用。小鼠腦室注射ERK1/2和cPLA2α的特異性阻斷劑AACOCF3和U0126可以使腦組織PGE2水平分別下降3.5和4倍。COX-2在正常生理條件下的小鼠大腦皮質中沒有表達，但其蛋白表達在LPS誘

9、導后明顯升高，sPLA2-ⅡA缺失又能降低這種表達。mPGES-1是PGE2生物合成過程末端的關鍵酶，LPS能夠誘導使其酶活性升高，而sPLA2-ⅡA缺失能夠阻斷LPS的這種作用。
　　2.乙酰葛根素在大鼠體內代謝為葛根素，藥動學過程符合二室模型，主要藥動學參數(shù)為經灌胃給藥葛根素AUC(0～∞)為(44.76±4.13)mg·L-1·h，經靜脈注射給藥AUC(0～∞）為(36.67±5.3)mg·L-1·h，與靜脈給予乙酰葛根素后

10、體內葛根素的暴露水平相比，灌胃給予葛根素后體內葛根素的暴露水平為48.12％（生物利用度為48.12％），經灌胃給藥Cmax和tmax，t1/2分別為(12.07±0.15)μg/mL、(1±0.33)h、(2.52±0.21)h。乙酰葛根素對星形膠質細胞無細胞毒性。為了檢測乙酰葛根素對大鼠星形膠質細胞炎癥反應的影響，我們分析了LPS刺激后細胞上清中兩種類花生酸，PGE2和LTC4的水平。結果表明，乙酰葛根素能夠劑量依賴性的抑制LPS引

11、起的PGE2和LTC4的釋放。為探討乙酰葛根素的保護作用是否涉及了groupⅤsPLA2的改變，我們通過westernblot和免疫熒光檢測了各組星形膠質細胞groupⅤsPLA2的表達和活性。結果提示乙酰葛根素可呈劑量依賴性抑制LPS誘導的星形膠質細胞中groupⅤsPLA2蛋白表達。cPLA2α是PGE2和LTC4產生的關鍵酶。前期的報道也提示，在多種刺激條件下，ERK1/2的磷酸化能夠引起cPLA2α的磷酸化。轉錄因子NF-κB能

12、夠在轉錄水平上調節(jié)花生四烯酸代謝酶。為了研究乙酰葛根素的保護作用機制，我們用westernblot檢測了LPS刺激后星形膠質細胞中cPLA2α，ERK1/2及NF-κBp65的磷酸化水平。結果表明，乙酰葛根素可以降低LPS所致groupⅤsPLA2下游蛋白ERK1/2及的磷酸化以及cPLA2α的活化，并且抑制p65的磷酸化。眾所周知COX-2和LOX-5分別是PGE2和LTC4生成的關鍵酶。MAPK-NF-κB能夠調節(jié)COX-2和LOX

13、-5的表達。我們下一步檢測了乙酰葛根素對LPS誘導引起的COX-2及LOX-5的表達的影響。LPS分別引起COX-2和LOX-5蛋白水平4倍和2倍的增加，而乙酰葛根素預處理能夠劑量依賴性地降低LPS的這種影響。
　　研究結論:
　　1.在原代培養(yǎng)的星形膠質細胞中，LPS誘導PGE2生物合成呈時間依賴性增多，并且伴隨sPLA2-ⅡAmRNA呈時間依賴性增加，蛋白含量亦增加。sPLA2-ⅡA阻斷劑SC-215可以阻斷LPS的作用

14、并且呈現(xiàn)劑量依賴性。體內實驗結果與體外一致，提示sPLA2-ⅡA缺失能夠改善LPS引起的神經炎癥反應。采用p38和MEK1/MEK2的阻斷劑，我們證明LPS誘導的cPLA2α的連續(xù)磷酸化和后續(xù)的PGE2的生物合成需要ERK1/2而不是p38的活化。體內試驗進一步證實，sPLA2-ⅡA通過持續(xù)活化ERK1/2來調節(jié)cPLA2α的磷酸化。我們的實驗結果也證明花生四烯酸代謝下游的兩種關鍵酶COX-2和mPGES-1都受到sPLA2-ⅡA的調控

15、。
　　2.高效液相色譜法可作為乙酰葛根素在大鼠體內藥動學的檢測手段。據文獻報道，灌胃葛根素后葛根素的絕對生物利用度僅為5％～6％;本研究結果表明，灌胃乙酰葛根素后葛根素在大鼠體內的暴露水平得到顯著提高（生物利用度提高至48.12％）。乙酰葛根素對急性實驗性炎癥模型具有較好的抗炎作用。乙酰葛根素的抗炎作用機制涉及到抑制炎癥過程中炎癥介質產生的上游信號分子，這可能是其發(fā)揮抗炎作用的部分機制。PGE2及LTC4合成的關鍵酶COX-2以