sPLA2在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，比如腦感染，腦缺血，腦外傷，中風(fēng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變都涉及神經(jīng)炎癥反應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥過(guò)程的一個(gè)重要特點(diǎn)就是促炎介質(zhì)的生成和釋放，花生四烯酸(AA)是其中的一類重要的促炎介質(zhì)?；ㄉ南┧岽x途徑最重要的酶促過(guò)程就是磷脂酶A2(PLA2)的水解。在病理?xiàng)l件下，PLA2將膜磷脂從Sn-2位脂?；鈹嗔?，釋放出花生四烯酸，AA經(jīng)代謝途徑下游的兩種關(guān)鍵酶，環(huán)氧酶(COX)和脂氧酶(LOX

2、)催化為前列腺素(PG)和白細(xì)胞三烯(LT)等類花生酸代謝產(chǎn)物，損傷腦細(xì)胞。PLA2是一類磷脂水解酶超家族，分布最廣泛的兩種亞型是胞質(zhì)磷脂酶A2(cPLA2)和分泌型磷脂酶A2(sPLA2)。目前對(duì)于脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥過(guò)程中sPLA2的功能還不明了。乙酰葛根素是將葛根素經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改良獲得的一種新型異黃酮類化合物，盡管我們已有的報(bào)道提示乙酰葛根素對(duì)腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，但其保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。
　　研究目的

3、:
　　研究sPLA2在LPS刺激所致大鼠大腦皮層炎癥以及星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。重點(diǎn)研究了新型異黃酮類化合物乙酰葛根素的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制，為其發(fā)展為治療神經(jīng)炎癥的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　本研究由兩部分組成:
　　1.利用原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)研究sPLA2-ⅡA在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的作用。采用RT-PCR來(lái)檢測(cè)在原代培養(yǎng)大鼠星

4、形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中sPLA2-ⅡAmRNA的表達(dá)。以ELISA檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中PGE2濃度。Westernblot檢測(cè)AA代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)。體內(nèi)試驗(yàn)采用小鼠腦室注射LPS建立腦炎癥損傷模型來(lái)研究sPLA2-ⅡA對(duì)小鼠大腦皮質(zhì)炎癥過(guò)程中MAPK-cPLA2α-PGE2通路的調(diào)節(jié)作用。采用ELISA來(lái)檢測(cè)小鼠大腦皮質(zhì)PGE2生成水平。Westernblot來(lái)檢測(cè)sPLA2-ⅡA，COX-2和mPGES-1蛋白表達(dá)水平以及ERK1/

5、2，p38和cPLA2α的磷酸化水平。
　　2.采用高效液相色譜法(HPLC)，對(duì)乙酰葛根素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程進(jìn)行了分析，同時(shí)利用原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞模擬體外炎癥模型研究乙酰葛根素在LPS誘導(dǎo)類花生酸合成過(guò)程中的作用機(jī)制。MTT法檢測(cè)乙酰葛根素對(duì)原代培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響。以western blot及免疫熒光染色檢測(cè)各蛋白表達(dá)水平，檢測(cè)乙酰葛根素是否可以抑制group(Ⅴ)sPLA2的蛋白水平以及阻斷LPS所致

6、ERK1/2/cPLA2α信號(hào)通路的激活。采用ELISA來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中PGE2和LTC4的釋放量?；ㄉ南┧岽x途徑的其他相關(guān)蛋白表達(dá)水平用western blot來(lái)檢測(cè)。
　　研究結(jié)果:
　　1.LPS能夠引起原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中sPLA2-ⅡAmRNA表達(dá)水平呈時(shí)間和劑量依賴性的增加;但在原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中沒(méi)有這一現(xiàn)象。因此我們利用原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)模擬體外炎癥條件，來(lái)研究sPLA2-ⅡA在LPS誘導(dǎo)PGE2

7、生物合成過(guò)程中的作用。在此實(shí)驗(yàn)中我們還引入了sPLA2ⅡA特異性阻斷劑SC-215，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中SC-215能夠劑量依賴性的降低LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的PGE2水平。體內(nèi)試驗(yàn)部分:腦室注射LPS時(shí)采用SC-215干預(yù)，可以使sPLA2-ⅡA的蛋白表達(dá)下降90％以上。與預(yù)期一致，PGE2的合成也在SC-215的干預(yù)下被明顯抑制（下降75％以上）。在小鼠大腦皮質(zhì)中，LPS能夠引起時(shí)間依賴性的cPLA2α的磷酸化，ERK1/2的磷酸化要先于cPL

8、A2α，并且在10min時(shí)便達(dá)到高峰。后續(xù)的磷酸化在30min時(shí)仍能檢測(cè)到，在60min時(shí)回到基礎(chǔ)水平。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sPLA2-ⅡA缺失能使小鼠大腦皮質(zhì)cPLA2α和ERK1/2的磷酸化水平被明顯抑制，但對(duì)p38的磷酸化沒(méi)有任何作用。小鼠腦室注射ERK1/2和cPLA2α的特異性阻斷劑AACOCF3和U0126可以使腦組織PGE2水平分別下降3.5和4倍。COX-2在正常生理?xiàng)l件下的小鼠大腦皮質(zhì)中沒(méi)有表達(dá)，但其蛋白表達(dá)在LPS誘

9、導(dǎo)后明顯升高，sPLA2-ⅡA缺失又能降低這種表達(dá)。mPGES-1是PGE2生物合成過(guò)程末端的關(guān)鍵酶，LPS能夠誘導(dǎo)使其酶活性升高，而sPLA2-ⅡA缺失能夠阻斷LPS的這種作用。
　　2.乙酰葛根素在大鼠體內(nèi)代謝為葛根素，藥動(dòng)學(xué)過(guò)程符合二室模型，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為經(jīng)灌胃給藥葛根素AUC(0～∞)為(44.76±4.13)mg·L-1·h，經(jīng)靜脈注射給藥AUC(0～∞）為(36.67±5.3)mg·L-1·h，與靜脈給予乙酰葛根素后

10、體內(nèi)葛根素的暴露水平相比，灌胃給予葛根素后體內(nèi)葛根素的暴露水平為48.12％（生物利用度為48.12％），經(jīng)灌胃給藥Cmax和tmax，t1/2分別為(12.07±0.15)μg/mL、(1±0.33)h、(2.52±0.21)h。乙酰葛根素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。為了檢測(cè)乙酰葛根素對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，我們分析了LPS刺激后細(xì)胞上清中兩種類花生酸，PGE2和LTC4的水平。結(jié)果表明，乙酰葛根素能夠劑量依賴性的抑制LPS引

11、起的PGE2和LTC4的釋放。為探討乙酰葛根素的保護(hù)作用是否涉及了groupⅤsPLA2的改變，我們通過(guò)westernblot和免疫熒光檢測(cè)了各組星形膠質(zhì)細(xì)胞groupⅤsPLA2的表達(dá)和活性。結(jié)果提示乙酰葛根素可呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中g(shù)roupⅤsPLA2蛋白表達(dá)。cPLA2α是PGE2和LTC4產(chǎn)生的關(guān)鍵酶。前期的報(bào)道也提示，在多種刺激條件下，ERK1/2的磷酸化能夠引起cPLA2α的磷酸化。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB能

12、夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝酶。為了研究乙酰葛根素的保護(hù)作用機(jī)制，我們用westernblot檢測(cè)了LPS刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞中cPLA2α，ERK1/2及NF-κBp65的磷酸化水平。結(jié)果表明，乙酰葛根素可以降低LPS所致groupⅤsPLA2下游蛋白ERK1/2及的磷酸化以及cPLA2α的活化，并且抑制p65的磷酸化。眾所周知COX-2和LOX-5分別是PGE2和LTC4生成的關(guān)鍵酶。MAPK-NF-κB能夠調(diào)節(jié)COX-2和LOX

13、-5的表達(dá)。我們下一步檢測(cè)了乙酰葛根素對(duì)LPS誘導(dǎo)引起的COX-2及LOX-5的表達(dá)的影響。LPS分別引起COX-2和LOX-5蛋白水平4倍和2倍的增加，而乙酰葛根素預(yù)處理能夠劑量依賴性地降低LPS的這種影響。
　　研究結(jié)論:
　　1.在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，LPS誘導(dǎo)PGE2生物合成呈時(shí)間依賴性增多，并且伴隨sPLA2-ⅡAmRNA呈時(shí)間依賴性增加，蛋白含量亦增加。sPLA2-ⅡA阻斷劑SC-215可以阻斷LPS的作用

14、并且呈現(xiàn)劑量依賴性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外一致，提示sPLA2-ⅡA缺失能夠改善LPS引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。采用p38和MEK1/MEK2的阻斷劑，我們證明LPS誘導(dǎo)的cPLA2α的連續(xù)磷酸化和后續(xù)的PGE2的生物合成需要ERK1/2而不是p38的活化。體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，sPLA2-ⅡA通過(guò)持續(xù)活化ERK1/2來(lái)調(diào)節(jié)cPLA2α的磷酸化。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明花生四烯酸代謝下游的兩種關(guān)鍵酶COX-2和mPGES-1都受到sPLA2-ⅡA的調(diào)控

15、。
　　2.高效液相色譜法可作為乙酰葛根素在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的檢測(cè)手段。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，灌胃葛根素后葛根素的絕對(duì)生物利用度僅為5％～6％;本研究結(jié)果表明，灌胃乙酰葛根素后葛根素在大鼠體內(nèi)的暴露水平得到顯著提高（生物利用度提高至48.12％）。乙酰葛根素對(duì)急性實(shí)驗(yàn)性炎癥模型具有較好的抗炎作用。乙酰葛根素的抗炎作用機(jī)制涉及到抑制炎癥過(guò)程中炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的上游信號(hào)分子，這可能是其發(fā)揮抗炎作用的部分機(jī)制。PGE2及LTC4合成的關(guān)鍵酶COX-2以