SPLUNC1在LPS誘導炎癥反應中的作用機制研究.pdf

1、目前認為慢性炎癥是20-25％的惡性腫瘤發(fā)生的主要驅動者，炎-癌分子機制的探討已成為癌變原理研究領域關注的重要焦點。革蘭氏陰性菌是與鼻咽部長期共存的主要病原微生物，是致鼻咽部慢性炎癥的常見因素。如果病原微生物長期持續(xù)刺激鼻炎上皮則會導致鼻咽局部形成慢性炎癥。眾所周知，細菌內毒素即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌主要毒力因素，它可作用于細胞膜受體CD14和TLR4，從而發(fā)揮生物學作用。
　　SPL

2、UNC1基因作為鼻咽及上呼吸道上皮細胞編碼一種分泌性蛋白，是細胞的固有免疫分子。前期研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1含有一個BPI結構域，BPI能與革蘭氏陰性細菌細胞壁上的LPS特異性地結合。重組的SPLUNC1蛋白能經(jīng)轉染細胞分泌到培養(yǎng)上清液中并具有結合細菌脂多糖，以及殺滅或抑制上呼吸道綠膿桿菌的功能。SPLUNC1在預防病原微生物感染和抑制過度炎癥反應方面起到重要作用。
　　本課題將在構建SPLUNC1基因封閉與基因剔除的細胞和動物模型

3、基礎上，深入研究LPS誘導的TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應中SPLUNC1預防或阻斷炎-癌反應過程的可能的作用和分子機制，并為鼻咽癌分子診治提供新靶點及新線索。
　　LPS可通過TLR4/NF-κB信號通路引起鼻咽癌細胞促炎因子的分泌和鼻咽癌細胞的增殖
　　慢性感染的重要毒力因素被認為是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分LPS，對LPS的識別與信號傳導是宿主細胞抵御革蘭氏陰性細菌的關鍵。同時LPS及其介導的TLR4信

4、號傳導途徑被認為是慢性感染導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要的因素。為了研究LPS引起的慢性炎癥對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的影響，本研究采用合適濃度的LPS(1ug/ml)作用于鼻咽癌細胞系5-8F和6-10細胞系。流式細胞周期分析和MTT結果發(fā)現(xiàn)LPS能夠促進鼻咽癌細胞系細胞周期進程進而引起細胞增殖。同時LPS刺激24小時后，Real-time PCR和ELISA檢測促炎因子IL-6，IL-8，TNF-α和IL-1β的表達發(fā)現(xiàn)，LPS能夠促進促炎因子的分泌

5、。LPS是TLR4的配體之一。為了瞭解LPS是否通過TLR4信號通路影響鼻咽癌細胞促炎因子的分泌和細胞增殖，本研究采用Western-blot和Real-time PCR檢測了TLR4信號通路相關分子的表達，結果發(fā)現(xiàn)LPS能顯著提高CD14，TLR4，MyD88，p-p65表達以促進促炎因子的分泌。采用免疫熒光技術和熒光素酶報告基因活性檢測發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導下，鼻咽癌細胞中NF-KB(p65)被活化進入細胞核內。NF/κB(p65)持續(xù)

6、活化是慢性炎癥發(fā)生的主要因素。因此本文認為:在鼻咽癌細胞中，LPS通過TLR4-MyD88-NF-κB(p65)信號通路來促進NF-κB(p65)的活化入核，導致促炎因子的大量分泌進而導致炎癥的持續(xù)發(fā)生和細胞增殖。
　　SPLUNC1與TLR4在正常和鼻咽癌患者組織中的動態(tài)表達
　　前期的研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1在正常鼻咽組織中高表達，而在鼻咽癌患者組織中低表達或者不表達;腫瘤細胞表面表達的TLR4能促進腫瘤的免疫逃逸從而促進

7、腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究利用鼻咽癌組織芯片采用免疫組化法觀察了SPLUNC1與TLR4在正常鼻咽組織和鼻咽癌組織中的表達情況，并分析了兩者表達的相關性以及對鼻咽癌患者的預后判斷。結果發(fā)現(xiàn)在正常鼻咽組織中SPLUNC1的高表達，而炎癥組織中SPLUNC1的表達減弱，鼻咽癌組織中SPLUNC1的表達逐漸消失;但是TLR4在正常鼻咽組織中呈弱表達，炎癥組織中TLR4表達升高，且在鼻咽癌組織中呈高表達。相關性分析得出SPLUNC1與TLR4的表達

8、呈負相關關系。Kaplan-Meier生存分析顯示SPLUNC1表達越低，TLR4表達越高，鼻咽癌患者預后越差。
　　SPLUNC1通過TLR4/NF-κB信號通路抑制LPS引起的促炎因子的分泌和細胞增殖
　　為了篩選合適的細胞系進行后續(xù)實驗，本研究對鼻咽癌細胞系進行了SPLUNC1和TLR4的表達篩選，Real-time PCR和WB觀察發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞系5-8F和正常鼻咽上皮細胞系NP-69較合適進行后續(xù)實驗。SPLUNC

9、1含有BPI結構域，能夠與細菌LPS結合，為了證實SPLUNC1是制約LPS引起的細胞增殖和促炎因子分泌的關鍵因素的設想，本研究構建了穩(wěn)定高表達SPLUNC1的5-8F細胞系和穩(wěn)定干擾SPLUNC1的NP69細胞系，并使用LPS(1ug/ml)刺激5-8F/ctrl和5-8F/SPLUNC1細胞系以及NP-69/Ctrl和NP69/SPLUNC1 si細胞系。通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉染SPLUNC1的5-8F細胞系明顯比空載體轉染細胞系

10、增殖慢，同時干擾SPLUNC1的NP69細胞系經(jīng)LPS刺激后增殖速度比對照組明顯加快。通過流式細胞技術也表明SPLUNC1基因能夠阻止LPS引起的細胞增殖，導致鼻咽癌細胞的生長阻滯在G0/G1期。同時Real-time PCR和ELISA實驗證實，SPLUNC1基因能夠在mRNA水平和蛋白水平抑制LPS引起的促炎因子IL-6，IL-8，TNF-α和IL-1β的分泌。以上結果證實SPLUNC1能夠抑制LPS引起的促炎因子的分泌和鼻咽癌細胞

11、的增殖。因為LPS可通過TLR4-MyD88-NF-κB(p65)信號通路促進鼻咽癌細胞系促炎因子的分泌和細胞增殖，于是本研究進一步驗證了SPLUNC1在這一過程中的作用。使用LPS（1ug/ml）刺激5-8F/ctrl和5-8F/SPLUNC1細胞系以及NP-69/Ctrl和NP69/SPLUNC1 si細胞系24小時后，收集蛋白進行Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，SPLUNC1能夠抑制LPS引起的TLR4、MyD88、p-p65(

12、NF-κB)表達的升高。熒光素酶報告基因檢測結果和免疫熒光結果顯示，盡管受到LPS的刺激，SPLUNC1也能阻止NF-κB入核，同時也能抑制NF-κB的轉錄活性。
　　為了在體內證實SPLUNC1抑制LPS引起的炎癥反應的功能，本研究構建了Splunc1基因敲除小鼠，取Splunc1敲除小鼠和野生型小鼠肺組織和MEF檢測Tlr4/Nf-κb通路關鍵分子的表達，并對Splunc1敲除小鼠和野生型小鼠進行腹腔注射LPS(5mg/kg)

13、刺激24小時后，取小鼠肺組織進行免疫組化檢測，同時收集小鼠外周血進行ELISA檢測。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)Splunc1敲除后，Splunc1敲除小鼠肺組織和MEF（Splunc1-/-）中Cd14，Tlr4、Myd88、p-p65(Nf-κb)表達的升高而Ikbα的表達降低。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)Splunc1敲除小鼠LPS刺激后，外周血中促炎因子Il-6，Il-8表達升高。
　　上述研究結果證明SPLUNC1基因可通過降