Toll樣受體2-4在高氧所致急性肺損傷炎癥反應中的作用及其機制的研究.pdf

1、第一部分、高氧所致大鼠急性肺損傷Toll樣受體2、4的變化
　　 目的：探討Toll樣受體（TLRs）在高氧所致急性肺損傷發(fā)病過程中的變化及作用。
　　 方法：將24只SD大鼠置于氧體積分數(shù)大于95％的密閉氧倉中，分別于氧氣暴露24、48、72h，8只呼吸正?？諝獾腟D大鼠作為對照組，活殺各組大鼠，取肺組織標本，測定肺濕/干重（W/D）比值以及肺組織形態(tài)學改變。用實時定量（real-time）PCR測定肺組織TLR2/T

2、L，R4基因的表達；用免疫印跡（Western Blotting）測定肺組織TLR2/TLR4蛋白的表達；用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定肺組織勻漿中IL-6的蛋白含量。
　　 結果：各高氧實驗組肺W/D比值較對照組明顯增高（P<0.01），隨高氧暴露時間的延長，肺組織呈現(xiàn)彌漫性肺泡炎和間質(zhì)水腫等病理學改變。Real-time PCR結果顯示高氧暴露組肺組織TLR2/TLR4基因表達明顯高于對照組（P<0.05），并與24h達

3、高峰。western Blotting結果顯示，高氧組TLR2/TLR4蛋白表達較對照組明顯增高（P<0.05），峰值分別在48h、72h；ELISA結果顯示高氧組肺組織勻漿IL-6蛋白含量較對照組明顯增高（P<0.05），48h達高峰。
　　 結論：在高氧引起急性肺損傷中，TLR2/TLR4在肺組織的炎癥的啟動和維持中起重要的作用。
　　 第二部分、高氧所致氧化應激狀態(tài)下肺泡上皮細胞Toll樣受體2/4表達及其功能研究

4、
　　 目的：觀察高氧暴露后，肺泡上皮細胞內(nèi)ROS水平與TLR2/4基因、蛋白表達變化及其信號通路的功能之間關系，探討高氧所致肺損傷炎癥反應的可能機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)人類肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549，分別在>90％氧體積分數(shù)高氧環(huán)境中暴露2h、6h、12h、24h及48h后（1）用流式細胞術檢測細胞內(nèi)活性氧含量；（2）用real-time PCR法檢測TLR2/4基因表達變化；（3）用流式細胞術檢測TLR2/4蛋白

5、在細胞中的分布及其表達改變；（4）用EMSA檢測A549在高氧暴露后，細胞內(nèi)NF-KB核轉錄的變化；（5）用ELIsA檢測A549在高氧暴露后，上清液中IL-6，IL-8的含量；（6）A549細胞予以ROS清除劑NAC預處理后，高氧暴露6h，再分別測定①用流式細胞術檢測細胞內(nèi)ROS含量；②real-time PCR法檢測TLR2/4基因表達變化；③用流式細胞術檢測TLR2/4蛋白表達改變；④用EMsA檢測細胞內(nèi)NF-KB核轉錄的變化；⑤

6、用ELISA檢測A549在高氧暴露后，上清液中IL-6，IL-8的含量。
　　 結果：A549肺泡上皮細胞有TLR2/4的表達，并且以胞內(nèi)表達為主，隨高氧暴露時間的延長，胞內(nèi)ROS含量呈進行性增高，TLR2/4表達隨之進行性增高，細胞內(nèi)NF-κB核轉錄水平及細胞上清液中IL-6，IL-8水平也呈進行性增高；在NAC預處理的情況下，高氧刺激后，細胞內(nèi)ROS水平明顯降低，細胞TL，R2/4表達也隨之降低，NF-κ B核轉錄活性水平及

7、細胞上清液中IL-6，IL-8水平增高不明顯，其變化與正常空氣A549細胞組無統(tǒng)計學差異，而明顯低于高氧暴露對照組。
　　 結論：A549細胞在高氧暴露后，細胞內(nèi)ROS能夠激活人肺泡上皮細胞TLR2/4的表達，導致前炎癥細胞因子IL-6和IL-8的大量釋放。這一過程可能是通過TL2/TLR4-NF-kB-炎癥介質(zhì)這一信號轉導通路實現(xiàn)的。
　　 第三部分、siRNA-TLR2和siRNA-TLR4對高氧所致氧化應激狀態(tài)下肺

8、泡上皮細胞功能的影響
　　 目的：觀察siRNA-TLR2和siRNA-TLR4轉染的A549細胞高氧暴露后，細胞TLR2/4基因、蛋白表達變化及其下游信號通路的功能，進一步證實細胞內(nèi)ROS可激活TL2/TLR4-NF-kB-炎癥介質(zhì)這一信號轉導通路，導致高氧肺損傷炎癥反應的啟動。
　　 方法：體外培養(yǎng)人類肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549，分別轉染siRNA-TLR2和siRNA-TL，R4，在>90％氧體積分數(shù)高氧環(huán)境中暴露

9、6h后（1）用real-time PCR法檢測TLR2/4基因抑制效率；（2）用流式細胞術檢測TLR2/4蛋白抑制效率；（3）用EMSA檢測轉染后A549在高氧暴露后，細胞內(nèi)NF-KB核轉錄的變化；（4）用ELISA檢測轉染后A549在高氧暴露后，上清液中IL-6，IL-8的含量；
　　 結果：siRNA-TL.R2和siRNA-TLR4可明顯抑制A549肺泡上皮細胞高氧暴露后TLR2/4的表達，并且可以降低高氧暴露后細胞內(nèi)NF