神經(jīng)介素U及其受體1在炎癥性腸病中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一組病因尚不明了的慢性腸道炎癥，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)。IBD病程遷延，顯著影響患者生活質(zhì)量，又有癌變威脅及發(fā)生出血、穿孔、梗阻和瘺管形成等嚴(yán)重并發(fā)癥的可能性。目前無(wú)論藥物或手術(shù)治療后，疾病均易復(fù)發(fā)，尚無(wú)根治的方法。因此闡明其病發(fā)病機(jī)制，為臨

2、床診療提供新思路及理論支持仍是我們面臨的重要任務(wù)和挑戰(zhàn)之一。目前，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，以及動(dòng)物模型研究的日趨成熟，其病因的探索已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，一幅內(nèi)皮細(xì)胞，腦-腸肽/激素，免疫及腸道黏膜內(nèi)的炎癥細(xì)胞之間相互作用造成黏膜炎癥的圖片已經(jīng)漸漸呈現(xiàn)在我們面前。近年來(lái)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用急性或慢性腸炎動(dòng)物模型研究結(jié)果表明，血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、P物質(zhì)（substa

3、nce P，SP）、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、神經(jīng)降壓素(neurotensin，NT)等與其在腸道黏膜相應(yīng)受體之間的抗原抗體反應(yīng)可促進(jìn)腸道黏膜炎癥的發(fā)生。盡管腦-腸肽/激素與IBD的關(guān)系還需要進(jìn)一步探討，目前的研究已提供了有益啟示，通過(guò)對(duì)腦-腸肽/激素研究可加深我們對(duì)炎癥性腸病的認(rèn)識(shí)，并為其治療開(kāi)辟嶄新的領(lǐng)域。
　　 神經(jīng)介素U(neuromedin U，NMU)于80年代首次從豬脊髓中發(fā)現(xiàn)并分離提純，

4、因其對(duì)大鼠子宮(uterus)平滑肌產(chǎn)生強(qiáng)烈收縮作用，故以U命名。隨著對(duì)NMU研究的深入，目前發(fā)現(xiàn)NMU是一種在胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng)廣泛分布的小分子多肽，不同物種的NMU在長(zhǎng)期進(jìn)化壓力下仍具有高度的保守結(jié)構(gòu)，表明NMU具有重要的生理功能。NMU通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮作用。NMU的兩個(gè)特異性的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)受體1(neuromedin U receptors

5、 1,NMUR1)和受體2(neuromedin U redceptor 2，NMUR2)（又名FM3和FM4）廣泛分布在動(dòng)物體內(nèi)，并具有不同的分布模式，從而使NMU顯示出多樣性的生理病理功能。NMUR1主要分布在胃腸道及泌尿系統(tǒng)，而NMUR2主要局限在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。現(xiàn)已證實(shí)NMU在調(diào)節(jié)平滑肌收縮、血壓與局部血流、腸胃離子轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝、攝食行為、胃酸分泌與胃排空、痛覺(jué)、癌癥等方面具有重要的作用。研究表明，NMU及其受體1均在胃腸道中高

6、表達(dá)，其在胃腸道正常的生理功能主要通過(guò)激活Gq/11蛋白調(diào)節(jié)鈣內(nèi)流，誘導(dǎo)腸道平滑肌收縮及蠕動(dòng)。實(shí)驗(yàn)證明，在野生型小鼠及NMUR2敲除小鼠中，NMU誘導(dǎo)的胃腸道平滑肌收縮及蠕動(dòng)，并未受到影響，另外因NMUR2受體主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，提示我們NMU/NMUR1軸而非NMU/NMUR2軸在胃腸道的正常生理功能中發(fā)揮主要的調(diào)節(jié)作用。隨著對(duì)NMU受體的深入研究，發(fā)現(xiàn)NMUR1而不是NMUR2分布在肺、脾臟及淋巴細(xì)胞等免疫器官及細(xì)胞，從而提示N

7、MU/NMUR1軸在免疫調(diào)節(jié)中也扮演了重要的角色。目前，神經(jīng)介素U在炎癥性疾病中的作用已經(jīng)在多個(gè)疾病模型得到證實(shí)，包括皮膚炎癥、感染性休克、哮喘及關(guān)節(jié)炎的NMU缺陷小鼠模型。
　　 但是，目前關(guān)于NMU參與炎癥性疾病的具體機(jī)制仍不清楚，國(guó)際上尚未見(jiàn)NMU與IBD相關(guān)聯(lián)系的報(bào)道。因此，為了進(jìn)一步探討IBD的發(fā)病機(jī)制為將來(lái)的治療提供更多的理論證據(jù)與支持，我們課題組將首次探討了NMU及其受體1-NMUR1在IBD中所扮演的角色。本課題

8、分二部分進(jìn)行， 第一部分，我們首先檢測(cè)NMU及NMUR1在IBD患者及5％硫酸葡聚糖（Dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)急性小鼠結(jié)腸炎模型病變結(jié)腸表達(dá)情況，初步明確NMU/NMUR1軸是否參與IBD發(fā)病;然后經(jīng)腹腔注射N(xiāo)MU中和抗體干預(yù)5％DSS誘導(dǎo)的急性小鼠結(jié)腸炎模型，觀察實(shí)驗(yàn)鼠的臨床癥狀、組織學(xué)損傷情況，腸道粘膜與腹腔巨噬細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況，從而探討NMU/NMUR1軸在IBD發(fā)病中的作用及可能機(jī)制。

9、第二部分，構(gòu)建NMUR1受體高表達(dá)的人結(jié)腸上皮細(xì)胞模型，應(yīng)用人NMU核心肽干預(yù)該細(xì)胞，然后應(yīng)用一系列分子生物學(xué)方法，初步探索NMU/NMUR1軸誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子IL-8表達(dá)、分泌所涉及的信號(hào)通路。
　　 第一部分：神經(jīng)介素U及其受體1在IBD患者及動(dòng)物模型的表達(dá)及作用機(jī)制的初步研究
　　 [目的]
　　 1.檢測(cè)NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠模型病變結(jié)腸段表達(dá)情況。
　　

10、 2.應(yīng)用NMU中和抗體干預(yù)急性小鼠結(jié)腸炎模型，研究NMU在腸道炎癥中的作用及可能機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1.定量Real-timePCR檢測(cè)NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及正常對(duì)照的結(jié)腸組織表達(dá)情況。
　　 2.急性結(jié)腸炎小鼠模型的建立及標(biāo)本的采集:FVB小鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃閮纱蠼M:第一大組:FVB小鼠25只，隨機(jī)分為5組，自由飲用5％DSS溶液8天。分別在第0，3,5，7，8天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠

11、，留取病變結(jié)腸段檢測(cè)NMU及NMUR1mRNA表達(dá)情況。第二大組:52只FVB小鼠，隨機(jī)分為4組，具體分組及干預(yù)如下:┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓┃分組小鼠（n）干預(yù)措施┃┣━━━━┳━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃┃┃┃自由飲用普通水，自第一天起，隔日┃┃┃對(duì)照IgG組┃6┃┃┃┃┃┃對(duì)照IgG(2mg/kg)腹腔注射。┃┃┣━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━

12、━━━━━━━━━━━┫┃對(duì)照組┃┃┃┃┃┃┃┃自由飲用普通水，自第一天起，隔日┃┃┃Anti-NMU組┃6┃┃┃┃┃┃NMU中和抗體(2mg/kg)腹腔注射。┃┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃┃┃┃自由飲用5％DSS水，自第一天起，隔┃┃┃對(duì)照IgG組┃20┃┃┃┃┃┃日對(duì)照IgG(2mg/kg)腹腔注射。┃┃┣━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃DSS組┃┃┃自由飲

13、用5％DSS水，自第一天起，隔┃┃┃Anti-NMU組┃20┃日NMU中和抗體(2mg/kg)腹腔注┃┃┃┃┃射。┃┗━━━━┻━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━┛比較各組小鼠的疾病活動(dòng)情況(DAI)評(píng)分、組織損傷評(píng)分、結(jié)腸重量/長(zhǎng)度以及、髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性等炎癥參數(shù)。另外，用Real-timePCR法檢測(cè)小鼠結(jié)腸段及腹腔巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-8，IL-1β，IL-6表達(dá)情況。
　　

14、 [結(jié)果]
　　 1.NMU及NMUR1mRNA在UC及CD患者及5％DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠模型病變結(jié)腸段表達(dá)水平均顯著升高。
　　 2.NMU中和抗體對(duì)DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎癥有保護(hù)作用。
　　 飲用普通水的對(duì)照組小鼠體重均有不同程度增加，無(wú)小鼠死亡，結(jié)腸無(wú)明顯縮短，MPO幾乎測(cè)不到。5％DSS造模組體重均有不同程度下降，但I(xiàn)gG組下降程度顯著高于anti-NMU組;anti-NMU組小鼠死亡率顯著低于IgG

15、組(15％vs0％，P＜0.05);anti-NMU組小鼠平均結(jié)腸重量與長(zhǎng)度的比值顯著低于IgG組(0.038g/cmvs0.049g/cm，P＜0.01);anti-NMU組DAI評(píng)分顯著低于IgG組;DSS致炎第8天，IgG組小鼠結(jié)腸黏膜充血水腫、潰瘍形成，腺體不完整或消失，結(jié)腸隱窩完全或部分缺失且黏膜固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，而anti-NMU組黏膜水腫少見(jiàn)，無(wú)潰瘍，腺體排列整齊，僅見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);組織學(xué)損傷評(píng)分示，

16、anti-NMU組評(píng)分顯著低于IgG組(1.2vs3.1，P＜0.05);5％DSS造模組小鼠炎癥結(jié)腸段MPO均有不同程度升高，但anti-NMU組顯著低于對(duì)照IgG組(60vs115，P＜0.05)。
　　 3.NMU中和抗體降低急性結(jié)腸炎小鼠病變結(jié)腸段炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平
　　 與IgG組相比，anti-NMU組小鼠病變結(jié)腸段IL-8及IL-6mRNA表達(dá)顯著下(P＜0.01);TNF-α，IL-1βmRNA表達(dá)水平

17、亦顯著降低(P＜0.05)。
　　 4.NMU中和抗體降低急性結(jié)腸炎小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平
　　 與IgG組相比，anti-NMU組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的IL-8及IL-6mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01);TNFα及IL-1βmRNA表達(dá)水平亦有下降(P＜0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及DSS誘導(dǎo)急性小鼠結(jié)腸炎模型病變結(jié)腸段顯著升高。

18、>　　 2.NMU中和抗體對(duì)DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠模型有保護(hù)作用，提示NMU是IBD發(fā)病重要的調(diào)節(jié)介質(zhì)。其機(jī)制可能與促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α表達(dá)分泌有關(guān)。
　　 第二部分：神經(jīng)介素U通過(guò)激活NF-κB及AP-1信號(hào)通路調(diào)節(jié)IL-8表達(dá)與分泌
　　 [目的]研究神經(jīng)介素U的高親和G蛋白偶聯(lián)受體1(NMUR1)活化后調(diào)節(jié)IL-8表達(dá)與分泌所涉及的信號(hào)通路
　　 [方法]
　

19、　 1.在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460基礎(chǔ)上構(gòu)建NMUR1穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株-NCM460-NMUR1。
　　 2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?yīng)用人NMU核心肽、信號(hào)通路藥物抑制劑及不同質(zhì)粒DNA干預(yù)NCM460-NMUR1細(xì)胞，然后應(yīng)用:(1)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-8濃度。(2)雙熒光素酶法檢測(cè)IL-8啟動(dòng)子活性。(3)WesternBlot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。(3)定量Real-timePCR檢測(cè)細(xì)胞c-jun和c-fosmR

20、NA表達(dá)水平。
　　 (4)ChIP分析:分析p65蛋白與IL-8啟動(dòng)子區(qū)κB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能力。
　　 [結(jié)果]
　　 1.NMU刺激NCM460-NMUR1細(xì)胞IL-8轉(zhuǎn)錄與分泌
　　 成功構(gòu)建NMUR1受體高表達(dá)細(xì)胞株NCM460-NMUR1，然后應(yīng)用NMU干預(yù)該細(xì)胞，收集上清檢測(cè)IL-8濃度。結(jié)果示，NMU可顯著誘導(dǎo)NCM460-NMUR1細(xì)胞分泌IL-8并呈濃度、時(shí)間依賴;雙熒光素酶結(jié)果示，NMU

21、顯著增強(qiáng)IL-8啟動(dòng)子活性，增強(qiáng)IL-8基因轉(zhuǎn)錄。
　　 2.NMU激活經(jīng)典N(xiāo)F-κB信號(hào)通路
　　 Westernblot結(jié)果示，NMU刺激NCM460-NMUR1細(xì)胞15分鐘即可引起細(xì)胞總IκBα蛋白降低，p-IκBα蛋白增高，細(xì)胞核p65蛋白增加，30-60分鐘達(dá)到最高水平。ChIP示NMU刺激15分鐘后，NCM460-NMUR1細(xì)胞核p65蛋白便開(kāi)始與IL-8啟動(dòng)子區(qū)κB位點(diǎn)結(jié)合，結(jié)合活性逐漸增強(qiáng)，30-60分鐘

22、達(dá)最高。
　　 3.阻斷NF-κB信號(hào)通路抑制NMU誘導(dǎo)的IL-8基因轉(zhuǎn)錄與分泌
　　 IL-8啟動(dòng)子區(qū)κB結(jié)合位點(diǎn)變異及IκBα表達(dá)質(zhì)?？娠@著降低NMU誘導(dǎo)IL-8轉(zhuǎn)錄活性增高;NF-κB信號(hào)通路抑制劑咖啡酸苯乙酯(CAPE)顯著降低NMU誘導(dǎo)IL-8分泌。
　　 3.NMU誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子AP-1亞單位c-un及c-fos表達(dá)活化
　　 Real-timePCR結(jié)果示，與對(duì)照組相比，NMU刺激NCM46

23、0-NMUR1細(xì)胞半小時(shí)，其c-jun及c-fosmRNA表達(dá)水平便顯著升高，在1小時(shí)達(dá)到最高水平后開(kāi)始下降。Westernblot結(jié)果與real-timePCR結(jié)果相符，NMU刺激NCM460-NMUR1細(xì)胞1小時(shí)c-Jun蛋白表達(dá)開(kāi)始升高，2小時(shí)c-Jun達(dá)最最高水平。
　　 4.AP-1信號(hào)通路調(diào)節(jié)IL-8表達(dá)
　　 應(yīng)用IL-8啟動(dòng)子區(qū)AP-1結(jié)合位點(diǎn)變異、c-JunsiRNA干擾c-Jun表達(dá)及A-Fos質(zhì)粒三

24、種分子生物學(xué)方法阻斷AP-1通路可顯著降低NMU誘導(dǎo)的IL-8轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，提示AP-1信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)IL-8基因轉(zhuǎn)錄。
　　 5.NMU激活MAPKs信號(hào)通路介導(dǎo)AP-1活化
　　 Westernblot結(jié)果示，NMU可活化p-ERK1/2，p38及p-JNK蛋白，其中p-JNK與p-p38在NMU刺激30分鐘時(shí)達(dá)高峰，而p-ERK1/2在刺激15分鐘時(shí)表達(dá)便達(dá)到最高水平;MAPKs特異性抑制劑PD98059（ERK

25、抑制劑）、SB203580(p38抑制劑)、SP600125(JNK抑制劑)均可顯著抑制NMU誘導(dǎo)NCM460-NMUR1細(xì)胞c-jun及c-fosmRNA表達(dá)，其中SB203580作用更明顯。3種抑制劑聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同效應(yīng)幾乎完全阻斷c-jun及c-fosmRNA表達(dá)。該研究結(jié)果提示MAPK信號(hào)通路是AP-1的上游信號(hào)分子。
　　 [結(jié)論]
　　 在NMUR1高表達(dá)的結(jié)腸上皮細(xì)胞，NMU與NMUR1結(jié)合后可激活重要炎癥信

26、號(hào)通路——經(jīng)典N(xiāo)F-κB及AP-1信號(hào)通路，活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1與IL-8啟動(dòng)子區(qū)κB及AP-1位點(diǎn)結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-8基因表達(dá)、分泌。
　　 [本研究的創(chuàng)新點(diǎn)]
　　 1.本課題組首次發(fā)現(xiàn)NMU及NMUR1mRNA在IBD患者及急性結(jié)腸炎小鼠模型病變結(jié)腸段顯著高表達(dá)。
　　 2.本課題組第一次研究NMU在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎中的功能及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)NMU是腸道炎癥中的促炎因子。
　　 3

27、.本課題組率先成功構(gòu)建NMUR1穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞模型，為將來(lái)進(jìn)一步研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 4.國(guó)際上首次闡明NMU與NMUR1結(jié)合后可以激活重要炎癥信號(hào)通路——經(jīng)典N(xiāo)F-κB信號(hào)通路及AP-1信號(hào)通路，調(diào)節(jié)IL-8表達(dá)分泌。
　　 [本課題不足之處]
　　 1.因臨床標(biāo)本難獲得，抗鼠神經(jīng)介素U及神經(jīng)介素U受體1抗體的缺乏，未檢測(cè)二者尤其是神經(jīng)介素U受體1在組織細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的定位表達(dá)。
　　 2.由于