核酸分子探針信號(hào)放大新策略及其在生物分析中的應(yīng)用.pdf

1、核酸分子探針是近年來發(fā)展起來的具有廣泛應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ纳锓治龉ぞ?。核酸分子探針由核酸序列?gòu)建而成，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)及其他非共價(jià)作用實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的識(shí)別，并通過光、電等信號(hào)將探針與目標(biāo)物的識(shí)別報(bào)告出來。核酸分子探針已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)和生物學(xué)組分物質(zhì)及許多物理參數(shù)的檢測。目標(biāo)物的廣泛性顯示了核酸分子探針的重要性。然而，由于核酸分子探針對(duì)目標(biāo)物的檢測是通過1∶1結(jié)合比率下實(shí)現(xiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)換，這種方式使核酸分子探針對(duì)目標(biāo)物的檢測靈敏度限制在一

2、定范圍之內(nèi)。為了提高檢測靈敏度，科學(xué)家們發(fā)展了各種各樣的放大方法。近年來，以nicking酶、核糖核酸酶H(RNaseH)等核酸酶輔助的信號(hào)放大方法以其設(shè)計(jì)簡單、靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)而受到越來越多的關(guān)注。然而，與此同時(shí)，這些方法的不足之處也逐漸暴露，如nicking酶輔助的方法通用性差、RNaseH輔助的方法探針不穩(wěn)定，目前的放大方法以傳統(tǒng)的核酸分子探針為工具，背景信號(hào)高、靈敏度低、無法實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中對(duì)目標(biāo)物的直接檢測等。為了解決這些問題

3、，本文分別發(fā)展了核酸外切酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ，ExoⅢ)、T7核酸外切酶(T7Exonuclease，T7Exo)及氧化石墨烯輔助的循環(huán)酶切信號(hào)放大方法(cyclicenzymaticamplificationmethod，CEAM)用于核酸及非核酸物質(zhì)的高靈敏檢測，并設(shè)計(jì)了氧化石墨烯保護(hù)RNA探針的方案，發(fā)展了質(zhì)量放大探針用于熒光偏振高靈敏檢測小分子的方法。這些核酸分子探針信號(hào)放大新策略，提高了目標(biāo)物的檢測物靈敏度，拓展了目

4、標(biāo)物的檢測范圍，使核酸分子探針在生物分析領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。論文主要分為以下幾個(gè)方面:
　　 一、核酸外切酶Ⅲ輔助的循環(huán)酶切信號(hào)放大方法用于高靈敏生物分析
　　 設(shè)計(jì)了以ExoⅢ為工具酶、線性分子信標(biāo)(linearmolecularbeacons，LMBs)為探針的CEAM用于DNA及非核酸物質(zhì)的高靈敏檢測。ExoⅢ以雙鏈DNA為作用底物，沿3'平末端或凹陷末端逐個(gè)水解3'單核苷酸。LMBs由線性的DNA鏈組成，用

5、于報(bào)告信號(hào)的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分別位于3'末端及倒數(shù)第二個(gè)核苷酸上。與鏈取代探針相比，LMBs使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)足夠靠近，從而提高了淬滅效率，降低了背景信號(hào);與目標(biāo)物的雜交不需要經(jīng)過競爭-取代的過程，從而提高了雜交速率，促進(jìn)了CEAM的發(fā)生。最終，該方法實(shí)現(xiàn)了0.12pMDNA的檢測。我們同時(shí)將CEAM用于非核酸物質(zhì)-可卡因的高靈敏檢測，并取得了良好的效果。
　　 二、T7核酸外切酶輔助的循環(huán)酶切放大方法及其在高靈敏micro

6、RNA檢測中的應(yīng)用
　　 發(fā)展了T7Exo輔助的CEAM并組合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rollingcircleamplification，RCA)用于microRNA（miRNA）的高靈敏檢測。T7Exo底物專一性強(qiáng)，不會(huì)對(duì)單鏈DNA產(chǎn)生非特異性降解。我們首先設(shè)計(jì)了T7Exo輔助的CEAM，同時(shí)，組合RCA技術(shù)，我們?cè)O(shè)計(jì)的雙放大方法實(shí)現(xiàn)了12fM的miRNA檢測。該方法可用于比較不同細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)含量，有望用于臨床診斷中疾病的檢

7、測。
　　 三、氧化石墨烯保護(hù)的DNA探針用于復(fù)雜體系中循環(huán)酶切信號(hào)放大檢測microRNA
　　 發(fā)展了氧化石墨烯（grapheneoxide，GO）保護(hù)的DNA探針用于復(fù)雜體系中CEAM方法檢測miRNA。GO能夠保護(hù)DNA不受核酸酶降解，結(jié)合DNaseⅠ對(duì)DNA的特異性水解性能，我們發(fā)展的GO保護(hù)的CEAM能夠?qū)崿F(xiàn)9pMmiRNA的檢測，并能夠在復(fù)雜生物樣品中對(duì)miRNA進(jìn)行直接定量。
　　 四、氧化石墨烯

8、保護(hù)的RNA探針用于生物分子的高靈敏分析
　　 發(fā)展了使用GO保護(hù)RNA探針長期穩(wěn)定存在的方法，并在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了GO保護(hù)的RNA核酸分子探針用于生物分子的高靈敏檢測。本章證明了GO能夠保護(hù)RNA探針在核酸酶、細(xì)胞裂解液及室溫長期放置下穩(wěn)定存在，從而發(fā)展了GO穩(wěn)定的RNA探針用于RNaseH輔助的CEAM，以及RNA核酸適體探針用于VEGF及茶堿的高靈敏檢測。這些探針具有較高的靈敏度和選擇性，更重要的是，GO保護(hù)的RNA探針不

9、需要復(fù)雜的操作，為RNA探針的廣泛使用提供了機(jī)會(huì)。
　　 五、質(zhì)量放大的變構(gòu)調(diào)控探針用于熒光偏振檢測小分子
　　 設(shè)計(jì)了質(zhì)量放大的變構(gòu)調(diào)控探針用于熒光偏振檢測小分子。本章中，我們發(fā)展一種質(zhì)量放大的變構(gòu)調(diào)控探針，該探針將蛋白質(zhì)與小分子的核酸適體組成一條熒光標(biāo)記的DNA鏈，并設(shè)計(jì)一條較短的互補(bǔ)鏈將其固定。只有蛋白質(zhì)存在時(shí)，該探針無法與蛋白質(zhì)結(jié)合。當(dāng)小分子目標(biāo)物出現(xiàn)時(shí)，小分子與蛋白質(zhì)的共同作用將互補(bǔ)鏈取代，并分別與對(duì)應(yīng)的核酸適