核酸探針信號轉(zhuǎn)換及放大新方法研究.pdf

1、核酸分子探針作為近年來發(fā)展起來的新型生物分析工具，主要是以核酸序列作為基本組成單元，以堿基配對及其他作用方式作為識別動力，最終以光、電等信號將探針與目標(biāo)物質(zhì)的相互作用輸出出來。核酸分子探針已經(jīng)成功應(yīng)用于生物小分子、核酸、蛋白質(zhì)及腫瘤細(xì)胞的檢測中。然而，傳統(tǒng)的核酸分子探針與目標(biāo)物主要是基于1∶1結(jié)合比率下實現(xiàn)分子識別及信號轉(zhuǎn)換，因此在針對不同目標(biāo)物的生物分析中通常需要合成多種熒光或者其他信號報告分子功能化的核酸探針，這在一定程度上將會增加

2、實驗繁瑣程度，提高實驗成本。此外，這種1∶1的信號轉(zhuǎn)換方式也會將核酸探針的檢測靈敏度限制在一定范圍之內(nèi)。因此，核酸探針的通用性及高靈敏檢測仍然是科研工作者面臨的重要挑戰(zhàn)。為了解決這些問題，本論文結(jié)合核酸工具酶、利用主客體間相互作用，同時結(jié)合三鏈分子開關(guān)、DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等構(gòu)建了一系列通用型核酸傳感平臺，實現(xiàn)了目標(biāo)DNA、生物小分子及細(xì)胞的放大檢測，并將其進(jìn)一步擴(kuò)展至腫瘤細(xì)胞的靶向治療中。主要開展了以下幾方面的工作:
　　一、基于

3、鏈置換反應(yīng)設(shè)計構(gòu)象可轉(zhuǎn)換的核酸探針用于單堿基多態(tài)性的檢測主要以鏈置換放大反應(yīng)為基礎(chǔ)，設(shè)計了一種包含有發(fā)夾Ⅰ和發(fā)夾Ⅱ兩部分構(gòu)象可轉(zhuǎn)換核酸探針。在目標(biāo)序列不存在時，探針呈發(fā)夾構(gòu)象Ⅰ，此時結(jié)構(gòu)Ⅱ的莖部互補序列部分被包含在結(jié)構(gòu)Ⅰ的莖部內(nèi),3'端為延長的單鏈DNA序列。由于缺少聚合反應(yīng)的引物因此不能發(fā)生聚合反應(yīng)。加入目標(biāo)序列之后，發(fā)夾Ⅰ被打開，Ⅱ的莖部被釋放出來重新形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并且3'端雜交成雙鏈充當(dāng)聚合反應(yīng)的引物。經(jīng)過反復(fù)多次的聚合置換即可以實

4、現(xiàn)目標(biāo)序列的高靈敏檢測。
　　二、基于主客體作用設(shè)計莖部性能可控的核酸探針用于目標(biāo)物的放大檢測在分子信標(biāo)兩末端分別標(biāo)記芘分子，通過向反應(yīng)體系中加入環(huán)糊精實現(xiàn)分子信標(biāo)熱穩(wěn)定性的調(diào)控及目標(biāo)物的信號放大檢測。芘分子與環(huán)糊精的包絡(luò)作用可以增加溶液中芘單體分子形成二聚體的機率，進(jìn)而調(diào)控分子信標(biāo)莖部的穩(wěn)定性，另外環(huán)糊精空腔內(nèi)的疏水性環(huán)境也可以有效的增強芘分子二聚體熒光。當(dāng)向反應(yīng)體系中加入待檢測物后，待檢測物與探針作用破壞其分子信標(biāo)構(gòu)象，此時末

5、端的芘分子脫離環(huán)糊精空腔，二聚體熒光降低，單體熒光上升，通過對整個過程中單體與二聚體熒光信號轉(zhuǎn)換的監(jiān)測可以實現(xiàn)生物分子的高靈敏檢測。
　　三、基于DNA三鏈分子開關(guān)構(gòu)建熒光核酸檢測平臺實現(xiàn)多目標(biāo)物的檢測(1)結(jié)合穩(wěn)態(tài)熒光檢測技術(shù)實現(xiàn)溶液體系中多目標(biāo)物的檢測。選擇末端分別標(biāo)記芘的分子信標(biāo)作為信號報告探針，同時在核酸適體末端延長T、C堿基作為捕獲探針，信號報告探針與捕獲探針在合適的pH條件下形成DNA三鏈分子開關(guān)結(jié)構(gòu)，此時信號探針兩端

6、標(biāo)記的芘分子相互遠(yuǎn)離，核酸適體序列暴露在外面進(jìn)行目標(biāo)物的識別。加入目標(biāo)物后，目標(biāo)物與核酸適體作用，破壞三鏈結(jié)構(gòu)，釋放出信號報告探針。通過監(jiān)測芘分子穩(wěn)態(tài)熒光的信號變化實現(xiàn)目標(biāo)物的定量檢測。另外，在不同目標(biāo)物存在時，只需要改變核酸適體序列即可實現(xiàn)多組份分析，檢測體系成本低，通用性好。
　　(2)結(jié)合時間分辨熒光技術(shù)實現(xiàn)復(fù)雜體系中汞離子(Hg2+)的檢測。首先在磁納米顆粒表面構(gòu)建三鏈分子開關(guān)，以富T的DNA序列作為Hg2+識別單元，雙芘

7、標(biāo)記的分子信標(biāo)作為信號報告探針。在Hg2+存在下，三鏈結(jié)構(gòu)破壞，捕獲探針與信號報告探針分離，釋放出的信號探針形成雙鏈分子信標(biāo)，其兩端標(biāo)記的芘分子靠近形成二聚體熒光。Hg2+與捕獲探針結(jié)合后通過磁分離可以進(jìn)一步避免Hg2+對芘二聚體熒光的淬滅作用，因此利用時間分辨熒光技術(shù)作為信號輸出手段可以實現(xiàn)復(fù)雜體系中Hg2+的檢測。
　　四、基于DNA三鏈分子開關(guān)構(gòu)建表面增強拉曼核酸檢測平臺實現(xiàn)目標(biāo)物的放大檢測(1)結(jié)合前面提出的DNA三鏈分子

8、開關(guān)，利用生物分子與核酸適體特異性結(jié)合引起銀納米顆粒與金膜基底之間的距離變化，從而導(dǎo)致拉曼“熱點”效應(yīng)的產(chǎn)生，由此實現(xiàn)銀納米顆粒表面功能化的拉曼報告分子的信號增強。同時，當(dāng)向體系中加入三鏈分子開關(guān)的捕獲探針時，銀納米顆粒與金膜基底的距離變大，促使拉曼增強信號減弱，整個過程可以實現(xiàn)生物分子的高靈敏檢測及拉曼活性基底的循環(huán)再生利用。
　　(2)如前幾章所述構(gòu)建三鏈分子開關(guān)作為分子識別部分，在目標(biāo)物存在下，三鏈分子開關(guān)被打開釋放出信號報

9、告探針引發(fā)DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。由于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成的長鏈DNA上修飾有很多巰基基團(tuán)，當(dāng)向其中加入拉曼信號分子功能化的金納米顆粒后，大量金納米顆粒通過“金-巰”鍵作用連接至長鏈DNA上并呈聚集狀態(tài)。此時，相鄰金納米顆粒之間的“熱點”作用大大加強，其表面功能化的拉曼信號分子產(chǎn)生局部磁場引起化學(xué)鍵的振動，從而產(chǎn)生很強的拉曼信號。因此可以實現(xiàn)多目標(biāo)物的拉曼放大檢測。
　　五、基于DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)構(gòu)建功能小分子的高效核酸探針輸送平臺將雜交