光學(xué)核酸分子探針信號(hào)放大策略用于生化分析的研究.pdf

1、核酸分子探針是具有廣泛用途的一類生化分析工具。典型的核酸分子探針由核酸分子序列和信號(hào)報(bào)告基團(tuán)組成，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)、親疏水作用、靜電吸附等非共價(jià)作用實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的識(shí)別，并通過光、電、磁等信號(hào)來(lái)報(bào)告探針與目標(biāo)物的識(shí)別事件。在不同信號(hào)模式的核酸分子探針中，光學(xué)核酸分子探針因其靈敏度高、檢測(cè)對(duì)象廣、檢測(cè)手段豐富、不需要復(fù)雜儀器，甚至僅憑肉眼就可識(shí)別等特點(diǎn)，得到了科研工作者的廣泛青睞和深入研究。然而一般來(lái)說，目標(biāo)物對(duì)核酸分子探針的信號(hào)觸發(fā)是按照

2、1:1的方式進(jìn)行的，即一個(gè)目標(biāo)物只能夠引發(fā)一個(gè)核酸分子探針的報(bào)告信號(hào)，這種方式限制了光學(xué)核酸分子探針對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度。為此，科研工作者們發(fā)展了各式各樣的信號(hào)放大方法，如核酸工具酶輔助的信號(hào)放大技術(shù)、基于核酸雜交的信號(hào)放大技術(shù)、基于納米材料的信號(hào)放大技術(shù)、基于熒光共軛聚合物的信號(hào)放大技術(shù)等。本論文以光學(xué)核酸分子探針為工具，以DNA和酶為檢測(cè)目標(biāo)，發(fā)展了一些新的信號(hào)放大技術(shù)，具體開展了以下五個(gè)方面的工作：
　　1．考察了環(huán)氧氯丙烷

3、交聯(lián)的β-環(huán)糊精聚合物對(duì)標(biāo)芘核酸分子探針的熒光增強(qiáng)能力，發(fā)展了一種新的信號(hào)放大策略，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA的檢測(cè)。標(biāo)記在核酸分子探針上的芘很容易進(jìn)入β-環(huán)糊精的疏水空腔內(nèi)，而芘對(duì)微環(huán)境的改變非常敏感，在疏水環(huán)境下發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光。隨著互補(bǔ)序列的加入，探針與互補(bǔ)序列雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)，使標(biāo)記在堿基上的芘因?yàn)榭臻g位阻離開疏水腔體，引起熒光的熄滅?；谶@樣的原理，本論文構(gòu)建了一個(gè)“turn off”的DNA熒光檢測(cè)方法，線性檢測(cè)范圍為5.0～30 nm

4、ol/L，檢測(cè)限為3.0 nmol/L。為了進(jìn)一步提高該方法的靈敏度，通過引入核酸外切酶I，把標(biāo)芘核酸分子探針?biāo)鉃閱魏塑账?，降低了芘與環(huán)糊精腔體主客體識(shí)別的空間位阻，提高了芘與β-環(huán)糊精聚合物主客體結(jié)合能力，使得芘的熒光進(jìn)一步增強(qiáng)，可將檢測(cè)限降低到0.9 nmol/L。
　　2．合成了一種新的陽(yáng)離子β-環(huán)糊精聚合物，并基于此聚合物對(duì)單標(biāo)記芘的核酸分子探針的熒光增強(qiáng)作用發(fā)展了一種熒光方法用于DNA、腺苷和汞離子的檢測(cè)。這種陽(yáng)離子β

5、-環(huán)糊精聚合物表面帶有氨基，在中性pH水溶液中帶正電荷。由于聚合物表面帶有正電荷，可以通過靜電吸附作用與標(biāo)記了芘的核酸分子探針結(jié)合，有利于芘進(jìn)入環(huán)糊精疏水腔體內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。隨著互補(bǔ)序列的加入，核酸分子探針與互補(bǔ)序列雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)，使芘因?yàn)榭臻g位阻離開疏水腔體，引起熒光的熄滅。相比于上一個(gè)工作，這種核酸分子探針只需要標(biāo)記一個(gè)芘，無(wú)需引入酶即可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的靈敏檢測(cè)，線性檢測(cè)范圍為1.25～5.0 nmol/L，檢測(cè)限為0.3 nm

6、ol/L，也表現(xiàn)出良好的選擇性，并可用于腺苷和汞離子的檢測(cè)。
　　3．基于納米金顆粒比色法和核酸雜交鏈?zhǔn)椒糯螅℉CR）技術(shù)發(fā)展了一種高靈敏檢測(cè)DNA的方法。當(dāng)目標(biāo)DNA不存在時(shí)，兩段發(fā)夾狀輔助探針 H1/H2在溶液中可以穩(wěn)定共存，并且由于發(fā)夾探針有一段6 nt的凸出末端能夠穩(wěn)定納米金顆粒，可以有效避免高鹽溶液引起的納米金顆粒團(tuán)聚。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)，目標(biāo)DNA可以與輔助探針H1/H2雜交引發(fā)HCR反應(yīng)，形成一段雙鏈的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)。而這

7、種 DNA長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)因?yàn)闆]有凸出末端，不能起到保護(hù)納米金顆粒的作用，當(dāng)加入高濃度的鹽時(shí)，納米金顆粒就會(huì)發(fā)生團(tuán)聚，然后納米金顆粒溶液顏色就會(huì)出現(xiàn)從紅到藍(lán)的變化。這個(gè)檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行，不需要酶的參與，也不需要分離洗脫、化學(xué)修飾和昂貴儀器。本工作結(jié)合HCR這種無(wú)酶的信號(hào)放大技術(shù)對(duì)納米金顆粒比色法進(jìn)行了有效的改進(jìn)，解決了傳統(tǒng)納米金顆粒比色法靈敏度差的缺點(diǎn)，裸眼比色的檢測(cè)限為100 pmol/L，用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)的檢測(cè)限為50 pmol/L

8、，相比于傳統(tǒng)納米金顆粒比色法檢測(cè)限降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，而且對(duì)單堿基突變的DNA鏈也表現(xiàn)出較好的選擇性。
　　4．基于限制性內(nèi)切酶和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展了一種可以對(duì)DNA甲基化酶活性進(jìn)行靈敏檢測(cè)的熒光方法。當(dāng)有Dam甲基化酶存在時(shí)，發(fā)夾探針甲基化酶識(shí)別位點(diǎn)上的腺嘌呤被甲基化，同時(shí)被限制性內(nèi)切酶Dpn I識(shí)別酶切。酶切產(chǎn)物可以作為引物與DNA模板結(jié)合觸發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物都有數(shù)千個(gè)可以和大量分子信標(biāo)雜交的重復(fù)單元，實(shí)現(xiàn)對(duì)信

9、號(hào)的放大。當(dāng)沒有Dam甲基化酶時(shí)，甲基化/酶切反應(yīng)和滾環(huán)擴(kuò)增放大反應(yīng)都不會(huì)啟動(dòng)，也沒有熒光信號(hào)的變化。該方法對(duì)甲基化酶的線性檢測(cè)范圍為0.5?30 U/mL，檢測(cè)限可以達(dá)到0.18 U/mL。該方法還可以應(yīng)用于評(píng)價(jià)甲基化轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，有望在藥物研發(fā)中得到應(yīng)用。
　　5．基于分子信標(biāo)發(fā)展了一種谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的高靈敏檢測(cè)方法。谷丙轉(zhuǎn)氨酶能夠催化轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，即將氨基從丙氨酸轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸上。這個(gè)轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的產(chǎn)物為丙酮酸和谷氨酸。在