肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A基因突變調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞機(jī)制及干預(yù)研究.pdf

1、目的：
　　 本研究通過(guò)構(gòu)建MEF2A野生型(WT)、MEF2A顯性負(fù)突變型(△21)及MEF2A siRNA的VSMCs細(xì)胞模型，觀察MEF2A基因突變對(duì)VSMCs增殖、遷移、表型和MAPK信號(hào)通路的影響。再觀察阿托伐他汀對(duì)這些MEF2A基因突變影響的干預(yù)作用。分別探討MEF2A基因突變與CHD的相關(guān)性和阿托伐他汀可能的非調(diào)脂抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、建立MEF2A基因突變的血管平滑肌細(xì)胞模

2、型
　　 用帶雙抗（青霉素和氯霉素，濃度為100單位/ml）含10％胎牛血清(FBS)的D/F培養(yǎng)基培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，每5天用0.25％胰蛋白酶消化傳代。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及Western blotting檢測(cè)α-SM-actin，鑒定VSMCs性狀。將VSMCs隨機(jī)分為四組，參照EntransterTM-D和EntransterTM-R納米聚合物轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染：(1)對(duì)照（空白）組：

3、轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒，即pc-DNA3.1(＋)-GFP質(zhì)粒；(2)WT組：轉(zhuǎn)染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-MEF2A(WT)質(zhì)粒；(3)△21組：轉(zhuǎn)染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-21堿基缺失型(△21)質(zhì)粒；(4)siRNA組：轉(zhuǎn)染MEF2AsiRNA。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA進(jìn)VSMCs。MEF2A質(zhì)粒均帶有Flag標(biāo)簽，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，通過(guò)Western blotting檢測(cè)Flag蛋白表達(dá)，以確認(rèn)MEF

4、2A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，并觀察對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)GFP熒光表達(dá)估算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，Western blotting測(cè)定對(duì)照組、WT組、△21組和siRNA組VSMCs細(xì)胞內(nèi)MEF2A蛋白表達(dá)，驗(yàn)證MEF2A基因突變的VSMCs細(xì)胞模型成功建立。
　　 2、MEF2A基因突變對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的影響
　　 將VSMCs按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分為四組：(1)對(duì)照（空白）組：轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1(＋)-GFP質(zhì)粒；(2)WT組：轉(zhuǎn)染MEF2

5、Apc-DNA3.1(＋)-MEF2A(WT)質(zhì)粒；(3)△21組：轉(zhuǎn)染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-21堿基缺失型(△21)質(zhì)粒；(4)siRNA組：轉(zhuǎn)染MEF2AsiRNA。應(yīng)用EntransterrM-D和EntransterrM-R納米聚合物轉(zhuǎn)染試劑，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA進(jìn)VSMCs。
　　 2.1測(cè)定VSMCs增殖變化：轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，靜息培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，消化收集后以每孔5×104的密度接種于96孔板，每組

6、VSMCs設(shè)3批，每批5復(fù)孔。用含10％胎牛血清的D/F培養(yǎng)基正常培養(yǎng)細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)各組細(xì)胞第1批24小時(shí)，第2批48小時(shí)，第3批72小時(shí)后，給每孔加入溴化噻唑基藍(lán)四唑(MTT)溶液(5mg/ml)20μl，維持培養(yǎng)4小時(shí)后終止培養(yǎng)。吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150μl DMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，全波段酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的570nm OD值。
　　 2.2測(cè)定VSMCs遷移變化：Millicell下室加入500ul含10ng

7、/ml血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)-BB的無(wú)血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，靜息培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，消化收集后用含0.1％胎牛血清的培養(yǎng)基制成5×105/ml細(xì)胞懸液，接種于Millicell上室，每孔200ul細(xì)胞懸液。繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后，用棉簽擦除Millicell上室內(nèi)復(fù)合碳酸膜膜面上層的VSMCs，將膜面下層的細(xì)胞HE染色，計(jì)算遷移的VSMCs數(shù)。
　　 2.3測(cè)定VSMCs表型變化以及p38和ERK1/2信號(hào)通路：轉(zhuǎn)染48

8、小時(shí)后，用Protease inhibitors細(xì)胞裂解液冰上充分裂解細(xì)胞。于4℃，12000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘后取上清液，運(yùn)用SDS-PAGE和Westernblotting法來(lái)測(cè)定上清液中α-SM-actin、SM22α、OPN、p38、磷酸化p38、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表達(dá)水平。
　　 3、阿托伐他汀干預(yù)對(duì)MEF2A基因突變的血管平滑肌細(xì)胞的影響將VSMCs按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分為三組：(1)WT組：轉(zhuǎn)染MEF2

9、Apc-DNA3.1(＋)-MEF2A(WT)質(zhì)粒；(2)△21組：轉(zhuǎn)染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-21堿基缺失型(△21)質(zhì)粒；(3)他汀組：轉(zhuǎn)染MEF2Apc-DNA3.1(＋)-21堿基缺失型(△21)質(zhì)粒。應(yīng)用EntransterTM-D納米聚合物轉(zhuǎn)染試劑，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA進(jìn)VSMCs。
　　 3.1測(cè)定VSMCs增殖變化：轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，靜息培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，消化收集后以每孔5×104的密度接種于96孔

10、板，每組VSMCs設(shè)3批，每批5復(fù)孔。用含10％胎牛血清的D/F培養(yǎng)基正常培養(yǎng)細(xì)胞，并向他汀組培養(yǎng)孔內(nèi)加入阿托伐他汀溶液至終濃度100μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)各組細(xì)胞第1批24小時(shí)，第2批48小時(shí)，第3批72小時(shí)后，給每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，維持培養(yǎng)4小時(shí)后終止培養(yǎng)。吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150μl DMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，全波段酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的570nm OD值。
　　 3.2測(cè)定VSMCs遷移

11、變化：Millicell下室加入500μl含10ng/mlPDGF-BB的無(wú)血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，靜息培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，消化收集后用含0.1％胎牛血清的培養(yǎng)基制成5×105/ml細(xì)胞懸液，接種于Millicell上室，每孔200ul細(xì)胞懸液，并向他汀組上室加入阿托伐他汀溶液至終濃度100μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后，用棉簽擦除Millicell上室內(nèi)復(fù)合碳酸膜膜面上層的VSMCs，將膜面下層的細(xì)胞HE染色，計(jì)算遷移的VSMCs

12、數(shù)。
　　 3.3測(cè)定VSMCs表型、p38和ERK1/2信號(hào)通路：轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，向△21他汀組加入阿托伐他汀溶液至終濃度100μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，用Protease inhibitors細(xì)胞裂解液冰上充分裂解細(xì)胞。于4℃，12000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘后取上清液，運(yùn)用SDS-PAGE和Westernblotting法來(lái)測(cè)定上清液中α-SM-actin、SM22α、OPN、p38、磷酸化p38、ERK1/2和磷酸化

13、ERK1/2的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.選用帶雙抗含10％FBS的D/F培養(yǎng)基，可成功培養(yǎng)人VSMCs。
　　 2.構(gòu)建MEF2A顯性負(fù)突變基因質(zhì)粒，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染進(jìn)VSMCs，是建立MEF2A顯性負(fù)突變突變基因的細(xì)胞模型一種有效方法。
　　 3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MEF2A siRNA可以有效阻斷MEF2A基因表達(dá)。
　　 4.MEF2A基因顯性負(fù)突變及沉默使VSMCs增殖和遷移能力增

14、加。
　　 5.MEF2A基因顯性負(fù)突變及沉默可使VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。
　　 6.p38和ERK1/2 MAPK信號(hào)通路參與了MEF2A基因突變對(duì)VSMCs的作用。
　　 7.阿托伐他汀可抑制MEF2A基因突變誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移。
　　 8.阿托伐他汀可抑制VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。
　　 9.阿托伐他汀可通過(guò)p38和ERK1/2 MAPK信號(hào)通路抑制MEF2A基因突變對(duì)VSMCs