CARMA1和A20基因異常對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的影響及MALT1cDNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：
　　檢查彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL）中CARMA1基因突變、A20基因突變及甲基化情況，探討其對(duì)DLBCL臨床過程、預(yù)后及腫瘤耐藥的影響，以發(fā)現(xiàn) DLBCL臨床發(fā)展和預(yù)后估計(jì)的相關(guān)因素，為淋巴瘤治療方案的制定提供理論參考；構(gòu)建MALT1基因cDNA質(zhì)粒載體，為后續(xù)研究MALT1基因?qū)LBCL的影響奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　收集貴陽醫(yī)學(xué)院附屬

2、醫(yī)院病理科2005年1月至2013年06月期間診斷的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤104例。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增CARMA1基因外顯子5、6、7、8、9及A20基因外顯子3、6、7，DNA直接測(cè)序檢查DLBCL腫瘤組織中A20基因啟動(dòng)子區(qū)5'CpG島甲基化的情況。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的PgP和Ki-67蛋白的表達(dá)情況。收集研究病例的臨床病理資料和隨訪，對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用化學(xué)方法合成 MALT1的cDNA并通過 PCR擴(kuò)增，

3、經(jīng) Xho I和HindIII雙酶切后插入pcDNA3.1-myc His(-)，經(jīng)轉(zhuǎn)化及克隆篩選后，提取陽性克隆質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序鑒定。
　　結(jié)果：
　　1、臨床病理資料：104例DLBC患者中男59例，女45例，男女之比：1.31:1。發(fā)病年齡24-87歲，發(fā)病中位年齡56歲，發(fā)病高峰年齡50-80歲；發(fā)生于結(jié)內(nèi)64例，結(jié)外40例；臨床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期20例，Ⅲ期15例，Ⅳ期30例；根據(jù)腫瘤細(xì)胞的來源，104例DL

4、BCL中ABC-DLBCL65例，GCB-DLBCL39例。
　　2、CARMA1基因突變檢測(cè):在104例DLBCL中，檢測(cè)出8例CARMA1基因第8號(hào)外顯子存在錯(cuò)義突變（143位由堿基A置換堿基G），即由絲氨酸（GGA，Ser）變?yōu)楸奖彼幔℅AA，Phe）?？偼蛔兟蕿?.6％（8/104）。外顯子5、6、7、9為野生型序列，均未發(fā)現(xiàn)突變。其中ABC-DLBCL突變率為10.8%(7/65)，GCB-DLBCL突變率為2.5%（

5、1/39）； IPI指數(shù)3-5的病例（15.4%，6/39）較IPI指數(shù)0-2（3.0%，2/65）的病例CARMA1突變率明顯增多，P=0.025；有B癥狀（6/38，15.8%）與無B癥狀（2/66，3.0%）病例之間CARMA1基因突變有明顯差異(P=0.021)；臨床分期晚的病例CARMA1基因突變發(fā)生率較分期早的病例有增多的趨勢(shì)。
　　3、A20基因突變檢測(cè)：在104例DLBCL中，發(fā)現(xiàn)18例A20基因存在3號(hào)外顯子錯(cuò)義

6、突變。表現(xiàn)為：（1）第3號(hào)外顯子73位堿基G置換堿基T，即由谷氨酸（TTC,Glu）→丙氨酸（TGC,Ala），（2）第3號(hào)外顯子208位堿基C置換堿基T，即由異亮氨酸（AAT,Ile）→纈氨酸（AAC,Val），（3）第3號(hào)外顯子131位堿基A置換堿基C，即由半胱氨酸（GCA,Cys）→苯丙氨酸（GAA，Phe）?？偼蛔兟蕿?7.3%（18/104）,其中第3號(hào)外顯子73位突變率在ABC-DLBCL18.5%(12/65)與 GCB-

7、DLBCL2.5%（1/39）病例之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)。外顯子6、7為野生型序列，均未發(fā)現(xiàn)突變。A20基因突變?cè)谂R床分期較早（I,II期）與較晚（III,IV期）病例之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（6/53:12/33），P=0.028; IPI指數(shù)0-2組與3-5組病例之間A20突變亦有差異（7/58:11/28）P=0.025。
　　4、A20的甲基化檢測(cè)：104例DLBCL中27例檢出A20基因5'調(diào)控區(qū)甲基化，甲基化率為

8、26%（27/104）。其中ABC-DLBCL組甲基化率35.4%（23/65），GCB-DLBCL甲基化率10.2%（4/39），兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。
　　5、CARMA1、A20基因異常之間的關(guān)系：DLBCL中CARMA1基因突變與A20基因突變、A20甲基化之間均無相關(guān)關(guān)系(r=0.303，r=0.142，P>0.05)，A20基因突變與A20甲基化之間有正相關(guān)關(guān)系(r=0.277，P<0.05)。

9、
　　6、DLBCL中PgP和Ki67表達(dá)及其與CARMA1和A20基因異常的關(guān)系：104例DLBCL中68例PgP陽性表達(dá)，表達(dá)率65.38%。27例Ki-67陽性率<40%，77例Ki-67陽性率≥40%。Ki67低表達(dá)與高表達(dá)病例之間A20基因突變有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1/27：17/77，P=0.030），A20甲基化（P=0.607）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PgP表達(dá)在A20基因突變與未突變病例之間（P=0.021）、A20甲基化與無甲基

10、化（P=0.012）病例之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在 CARMA1基因突變病例與未突變病例之間 PgP及Ki-67表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.171），（P=0.366）。
　　7、隨訪：104例DLBCL中62例獲隨訪，獲訪率59.6%。隨訪分析發(fā)現(xiàn)：DLBCL復(fù)發(fā)率在ABC-DLBCL和GCB-DLBCL病例之間（P=0.020）、Ki67高表達(dá)與低表達(dá)病例之間（P=0.013）及有和無A20基因甲基化病例之間（P=0.017）有明

11、顯差異；CARMA1基因突變、A20基因突變、Ki67表達(dá)率、IPI指數(shù)及B癥狀都與DLBCL的預(yù)后不良相關(guān)，（P=0.051，P=0.013，P=0.021，P=0.012，P=0.025），而A20甲基化、原發(fā)部位、臨床分期、性別、血LDH水平、年齡、PgP表達(dá)均與DLBCL的預(yù)后無關(guān)（P均大于0.05）；CARMA1基因突變與未突變病例、A20基因突變與未突變病例之間的生存狀況有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.017，P=0.016），而A2

12、0甲基化與無甲基化病例之間、ABC-DLBCL與GCB-DLBCL病例之間生存曲線差異無顯著性（P均大于0.05）。
　　8、MALT1cDNA載體構(gòu)建及篩選：化學(xué)合成的MALT1cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切后見目的條帶，連接轉(zhuǎn)化后，質(zhì)粒DNA測(cè)序顯示目的片段插入正確。
　　結(jié)論：
　　1、DLBCL部分病例中少數(shù)病例存在CARMA1和A20基因的錯(cuò)義突變以及A20基因的甲基化。A20基因第3號(hào)外顯子73位堿基突變與DL

13、BCL的細(xì)胞來源有關(guān)，ABC-DLBCL病例中多見。A20基因突變與甲基化常同時(shí)存在。
　　2、CARMA1和A20基因突變及A20基因甲基化對(duì)DLBCL的臨床病理特征有一定影響。A20基因突變病例有較高的腫瘤細(xì)胞增殖活性，A20突變和甲基化病例有較高的PgP表達(dá)。
　　3、A20基因甲基化的DLBCL病例復(fù)發(fā)率較高，有基因突變的病例生存狀況較差。A20和CARMA1基因異?？赡苁荄LBCL不良預(yù)后的相關(guān)預(yù)測(cè)因子。