彌漫大B細胞淋巴瘤全基因表達譜分析及臨床病理研究.pdf

1、目的:
　　彌漫大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤最常見的類型,也是一類在臨床表現(xiàn),病理形態(tài)和遺傳學特征方面具有非常異質(zhì)性的B細胞淋巴瘤。本研究通過對60例彌漫大B細胞淋巴瘤全基因組表達譜的研究,進行分子分型并篩選出差異表達的基因。并且在mRNA和蛋白水平驗證篩選的差異基因的表達,進一步探討彌漫大B細胞淋巴瘤的分子預(yù)后標志及免疫組化蛋白水平的臨床病理分型。

2、>　　方法:
　　(1)基因芯片表達譜研究:收集60例OCT包埋的彌漫大B細胞淋巴瘤冰凍組織,臨床資料及隨訪資料均相對較齊全,選用Affymetrix公司HGU133 Plus2.0全基因組表達芯片,進行彌漫大B細胞全基因組表達譜芯片的檢測和分析。
　　(2)運用實時定量PCR(quantitative real-time PCR)方法進行差異基因的mRNA水平的驗證及相關(guān)預(yù)后的研究:入組標本為基因表達譜分析的彌漫大B細胞淋

3、巴瘤60例進行mRNA水平的驗證,另外增加收集2004年1月-2009年9月間復(fù)旦大學附屬腫瘤醫(yī)院OCT試劑包埋冰凍組織19例(Hans臨床免疫組化分型的6例GCB-DLBCL及13例non-GCB-DLBCL)共79例DLBCL進行相關(guān)預(yù)后的研究。根據(jù)基因芯片表達譜的差異基因篩選結(jié)果,用實時定量PCR技術(shù)(SYBR green I)的方法,分別檢測11種相關(guān)基因,5個GCB-DLBCL表達下調(diào)基因(CCND2、BCL-2、FOXPl,

4、IL6、STAT3),其中2個與JAK-STAT信號通路有關(guān)(IL6、STAT3):2個GCB-DLBCL表達上調(diào)基因(BCL-6、TP53);另外還有4個在基因芯片檢測無表達量的變化,但文獻報道與預(yù)后相關(guān)的基因(LM02、FN1、SCYA3、BCL7A)。表達相對量的計算采用2-△△Ct法,通過對79例DLBCL的相對mRNA表達量的分析,并與臨床資料相對照,探討彌漫大B細胞淋巴瘤的預(yù)后因素。
　　(3)組織芯片結(jié)合基因芯片對彌

5、漫大B細胞淋巴瘤病理分型的探討:收集2000年1月-2009年9月間復(fù)旦大學附屬腫瘤醫(yī)院石蠟包埋淋巴結(jié)組織335例,包括彌漫大B細胞淋巴瘤,非特指(DLBCL-NOS)271例,濾泡性淋巴瘤(3級)23例,Burkitt淋巴瘤(BL)14例,富于T和組織細胞彌漫大B細胞淋巴瘤(T/HR-DLBCL)11例,間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)6例,淋巴組織反應(yīng)性增生10例。所有病例的石蠟包埋組織,進行HE染色形態(tài)觀察,由兩位高年資病理醫(yī)生復(fù)片

6、,根據(jù)鏡下形態(tài)和免疫組化指標診斷和分型。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　(1)60例行基因表達譜分析的DLBCL臨床特征:60例DLBCL男性34例,女性26例,男女比例約為1.3:1;年齡分布在14歲至86歲,平均年齡56.8歲;59例有臨床隨訪資料,51例有臨床分期資料。按Hans分類標準,GCB病例20例,non-GCB病例40例(其中EB病毒感染6例)。臨床特征在患者性別、臨床分期之間無明顯統(tǒng)計學意義(p＞0

7、.05),EBV感染多見ABC-DLBCL患者(p＜0.05)。DLBCL組織學類型主要為中心母細胞變型,免疫母細胞變型及少數(shù)間變樣變型。
　　(2)基因芯片分析結(jié)果:60例DLBCL在分子基因水平被分成了三型,經(jīng)過監(jiān)督聚類及非監(jiān)督聚類和文獻中分子分型的對照,在分子水平均可分為三型,即GCB-DLBCL、ABC-DLBCL和Type3一DLBCL,其中GCB-DLBCL型20例,ABC-DLBCL型26例,Type3-DLBCL型

8、14例。20例Hans分型為GCB-DLBCL標本中,通過基因芯片分型證實有15例為GCB-DLBCL,2例為ABC-DLBCL,3例為Type3一DLBCL;40例Hans分型為Non-GCB-DLBCL標本中,5例為GCB-DLBCL,24例為ABC-DLBCL,11例為Type3一DLBCL。
　　根據(jù)基因芯片分析的結(jié)果,GCB-3LBCL診斷符合率為75％,而non-GCB-DLBCL診斷符合率為87.5％,Kappa檢驗

9、分析,檢測結(jié)果具有相關(guān)性(p＜0.01)。另外篩選出2,170個差異基因,進行了相應(yīng)的功能分析,在pathway功能分析(KEGG)中發(fā)現(xiàn)JAK-STAT3信號通路的基因在ABC-DLBCL較GCB-DLBCL上調(diào)。應(yīng)用基因表達譜在分子水平分為GCB-DLBCL,ABC-DLBCL和type3-DLBCL三組標本和Hans免疫組化分析后在蛋白水平分為GCB和Non-GCB二組標本,分別統(tǒng)計各組病例的無病生存率(Disease-free

10、survival,DFS),應(yīng)用Kaplan-Meier方法分別進行生存分析,分子分型GCB-DLBCL,ABC-DLBCL和type3三組標本和蛋白分型GCB和Non-GCB二組標本均無明顯統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　第二部分:
　　(1)79例DLBCL行實時定量PCR分析的DLBCL臨床特征:男性46例,女性33例,男女比例約為1.4:1;年齡分布在14歲至86歲,中位年齡58歲;78例有臨床隨訪資料,69例有臨

11、床分期資料。按Hans免疫組化分類標準,GCB-DLBCL病例26例,non-GCB-DLBCL病例53例,患者的性別及臨床分期無明顯統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　(2)分別將11個挑選的基因進行臨床預(yù)后研究,發(fā)現(xiàn)BCL-2、IL6、STAT3、BCL-6、TP53、LM02、FNl、SCYA3、BCL7A共9個基因和預(yù)后無明顯相關(guān)(p＞0.05);而CCND2,FOXP1和臨床分期有提示預(yù)后的意義(p＜0.01),但Cox回

12、歸模型分析后發(fā)現(xiàn)僅有臨床分期對DLBCL生存有顯著影響(p＜0.05)。臨床特征方面,患者的年齡和性別經(jīng)生存分析與預(yù)后無關(guān)(p＞0.05),而臨床分期與腫瘤的預(yù)后明顯相關(guān)(p＜0.01)
　　第三部分:
　　(1)335例組織芯片淋巴瘤患者臨床特征:271例彌漫大B細胞淋巴瘤,非特指(DLBCL-NOS)男性15l例,女性120例,男女比例約為1.3:1;年齡分布在9歲至87歲,中位年齡58歲;按Hans免疫組化分類標準,G

13、CB病例65例,non-6CB病例206例。
　　(2)依據(jù)免疫組化標記在DLBCL的表達情況,通過不同組間的統(tǒng)計學分析,發(fā)現(xiàn)免疫組化分型(IHC分型)中在組間表達有差異的基因有CD10、BCL-6、MUM1和Cyclind2(p＜0.05),基因表達譜分型(GEP分型)中在組間表達有差異的基因有CD10、BCL-6、Cyclind2(CCND2)和CD44(p＜0.05)。在.Hans免疫組化分型的基礎(chǔ)上,增加Cyclind2和

14、CD44抗體標記,可提高DLBCL臨床病理分型和診斷的準確性。
　　結(jié)論:
　　(1)應(yīng)用Affymetrix全基因芯片表達譜分析了60例彌漫大B細胞淋巴瘤。分別通過非監(jiān)督聚類、監(jiān)督聚類及文獻篩選基因的聚類分析,均能在分子水平將DLBCL分成明確的三型:ABC-DLBCL、GCB-DLBCL和type3一DLBCL。
　　(2)經(jīng)基因和蛋白水平的驗證,基因表達譜能較準確用于DLBCL的分子分型及差異基因的篩選。

15、　　(3)通過對11種與預(yù)后相關(guān)基因的生存分析,CCND2,FOXP1在本研究中具有一定的預(yù)后提示作用,但可能不能成為獨立的預(yù)后指標。臨床分期對DLBCL生存有顯著影響(p＜0.05)。
　　(4)在Hans免疫組化分型的基礎(chǔ)上,增加Cyclind2和CD44抗體標記,可提高DLBCL臨床病理分型和診斷的準確性。即Cyclind2和CD44陽性更傾向于GCB-DLBCL;Cyclind2和CD44陰性則要考慮有無Non-6CB-D