PD-1和TIM-3在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常見的類型，在歐美國(guó)家?guī)缀跽妓蠳HL的1/3，在亞洲國(guó)家占NHL大于40％[1]。這類淋巴瘤占以前臨床上的“侵襲性”或“中高度惡性”淋巴瘤的大多數(shù)病例。DLBCL在形態(tài)學(xué)、免疫表型、遺傳學(xué)和臨床表現(xiàn)極具異質(zhì)性[2]，其生長(zhǎng)迅速，但是一般對(duì)治療反應(yīng)較好，5年生存率可達(dá)75-80％，經(jīng)過CHOP樣方案治療，3/4的患者在治療后沒有癥狀，近50％患者可以治愈，但是仍有30％-40

2、％的DLBCL出現(xiàn)初始原發(fā)耐藥、疾病殘留或完全緩解后復(fù)發(fā)，盡管高劑量解救性化療和造血干細(xì)胞移植可提高復(fù)發(fā)/難治患者的有效率，但絕大多數(shù)患者最終復(fù)發(fā)。近幾年，針對(duì)與腫瘤發(fā)生有關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路、原癌基因和抑癌基因、細(xì)胞因子及受體的分子靶向藥物治療已初顯成效[3-6]。因此，進(jìn)一步研究本疾病的發(fā)病機(jī)理和新的治療方法尤為重要。
　　近年來，隨著腫瘤免疫學(xué)研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的各個(gè)階段，腫瘤與機(jī)體免疫系統(tǒng)

3、存在著復(fù)雜多變的關(guān)系。許多腫瘤相關(guān)抗原被確認(rèn)為自身免疫系統(tǒng)的成分[7]，因此腫瘤免疫在某種程度上可以說是自身免疫，而自身免疫耐受可能阻礙腫瘤免疫過程[8]。在自身免疫耐受的諸多機(jī)制中，目前的研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在自身免疫耐受中扮演著重要的角色，它們的缺陷和功能失調(diào)將直接引起自身免疫性疾病[9]。T細(xì)胞的活化是由兩種活化信號(hào)共同參與的，第一信號(hào)首先由T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別抗原，然后經(jīng)CD3分子將刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)[10]。第二信號(hào)是由

4、抗原提成細(xì)胞或靶細(xì)胞表面的協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)的協(xié)同刺激分子相互作用而產(chǎn)生的。而協(xié)同刺激分子是受共刺激因子和共抑制因子調(diào)節(jié)的，調(diào)節(jié)著T細(xì)胞激活的強(qiáng)度和免疫應(yīng)答的幅度。但是，T細(xì)胞在慢性病毒感染或長(zhǎng)時(shí)間接觸腫瘤抗原時(shí)就會(huì)異常表達(dá)共抑制因子，其效應(yīng)功能就會(huì)受到抑制而不能發(fā)揮正常作用。因此，研究這些協(xié)同刺激信號(hào)有助于探索新的免疫治療策略。PD-1和TIM-3是協(xié)調(diào)刺激分子家族重要成員，均屬于負(fù)性調(diào)控因子，不僅參與調(diào)節(jié)自身免疫過程，而且

5、在腫瘤免疫中也起著重要作用。
　　PD-1（程序性死亡受體-1，programmed death1）為CD28超家族成員，主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞上，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化并上調(diào)效應(yīng)期的淋巴細(xì)胞功能。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠PD-1基因可導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生，提示PD-1很可能是一種重要的免疫抑制分子，在免疫耐受及腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用。因此，以PD-1為靶點(diǎn)研究對(duì)抗腫瘤、抗自身免疫性疾病等均有重要

6、的意義[11，12]。TIM-3(T lymphocyte immune globulinmucin-3)是T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白(TIM)基因家族成員，高表達(dá)于輔助性T細(xì)胞1(Th1)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)上，并產(chǎn)生抑制性信號(hào)從而導(dǎo)致Th1和CTL細(xì)胞的凋亡[13，14]。TIM-3引起Th1細(xì)胞程序性死亡的原因是TIM-3能與其配體半乳糖凝集素-9（Galectin-9，Gal-9）特異性結(jié)合，提供負(fù)性共刺激信號(hào)所致。因此，

7、TIM-3可下調(diào)Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是一種負(fù)性免疫調(diào)控因子。研究顯示，TIM-3對(duì)除Th1和CTL細(xì)胞外的其他類型免疫細(xì)胞也具有調(diào)節(jié)作用，在一些自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，其免疫調(diào)節(jié)功能成為研究的熱點(diǎn)[15]。也有研究表明[16-18]，PD-1或/和TIM-3在實(shí)體瘤組織T淋巴細(xì)胞高表達(dá)，通過抗體阻斷PD-1和/或TIM-3信號(hào)通路能夠使腫瘤特異性T細(xì)胞的抗腫瘤活性得到恢復(fù);封閉PD-1或/和TIM-3基因可以抑

8、制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，PD-1和TIM-3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖及凋亡中可能也起著重要作用。
　　因此，本研究首先檢測(cè)了DLBCL患者外周血CD3+T細(xì)胞上PD-1和TIM-3的表達(dá)水平，分析其表達(dá)與臨床指標(biāo)、化療療效的關(guān)系，對(duì)比化療前后PD-1和TIM-3的變化，希望該研究能夠?yàn)閷鞤LBCL發(fā)病機(jī)理研究、進(jìn)一步判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。本研究還通過慢病毒介導(dǎo)，分別靶向沉默人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株OCI-L

9、y19中的PD-1基因和TIM-3基因，初步探討沉默PD-1基因、TIM-3基因?qū)θ藦浡驜細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株OCI-Ly19的增殖、克隆、周期及凋亡的生物學(xué)行為的影響，進(jìn)而為DLBCL的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。
　　目的：
　　1.探討PD-1和TIM-3在DLBCL患者CD3+T細(xì)胞的表達(dá)水平。
　　2.分析PD-1和TIM-3的表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系。
　　3.對(duì)比DLBCL患者化療前后PD-1和TIM-3的變

10、化。
　　4.分析PD-1和TIM-3的表達(dá)與化療療效的關(guān)系。
　　5.研究沉默PD-1基因、TIM-3基因?qū)CI-Ly19細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期分布的影響。
　　6.探討沉默PD-1基因、TIM-3基因?qū)CI-Ly19細(xì)胞的克隆形成及凋亡的影響。
　　方法：
　　1.46例初診DLBCL患者和30例健康對(duì)照者作為本研究的對(duì)象。
　　2.采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)化療前后患者與對(duì)照者PD-1和TIM-3的表

11、達(dá)率。
　　3.分別構(gòu)建PD-1、TIM-3慢病毒載體，用293T包裝濃縮生成病毒液，感染OCI-Ly19細(xì)胞，即PD-1基因沉默組(Lv-PD-1)、TIM-3基因沉默組（Lv-TIM-3）作為實(shí)驗(yàn)組，另分別設(shè)陰性對(duì)照組(Lv-Con)和空白對(duì)照組(Con)。
　　4.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot檢測(cè)慢病毒感染后PD-1、TIM-3基因和蛋白的表達(dá)。
　　5.采用CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)OCI-

12、Ly19細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡情況。
　　6.所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，應(yīng)用GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.在DLBCL患者CD3+T細(xì)胞中PD-1和TIM-3的表達(dá)率都較正常對(duì)照者明顯升高。
　　2.PD-1和TIM-3在Ⅰ/Ⅱ期DLBCL患者中無明顯變化，但在Ⅲ/Ⅳ期患者中的表達(dá)顯著增加。
　　3.DLBCL患者中有B癥狀者、IPI評(píng)分＞

13、2分者、LDH及Ki-67水平高者PD-1和TIM-3的表達(dá)水平亦升高。
　　4.PD-1和TIM-3的表達(dá)水平在化療前、標(biāo)準(zhǔn)化療2個(gè)療程后、4個(gè)療程后逐漸下降。
　　5.低表達(dá)PD-1和TIM-3患者的治療有效率高于高表達(dá)者。
　　6.PD-1基因沉默組OCI-Ly19細(xì)胞PD-1mRNA及PD-1蛋白含量明顯下降;TIM-3基因沉默組OCI-Ly19細(xì)胞TIM-3mRNA及TIM-3蛋白含量也明顯下降。
　　

14、7.與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，沉默PD-1、TIM-3基因后OCI-Ly19細(xì)胞的增殖能力明顯下降，G0/G1期的細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例下降。
　　8.沉默PD-1、TIM-3基因后OCI-Ly19細(xì)胞克隆形成能力與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比下降，凋亡率升高。
　　結(jié)論：
　　1.DLBCL患者CD3+T細(xì)胞PD-1和TIM-3的水平升高，其表達(dá)與DLBCL的分期、預(yù)后及增殖均有關(guān)，在DLBCL的發(fā)展中起重要作