早期診斷唐氏綜合征的母體血清蛋白新標(biāo)志物篩選與驗(yàn)證.pdf

1、目的： 利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析、驗(yàn)證孕中期(14-20周)唐氏綜合征(21三體，Down'ssyndrome DS)胎兒母體血清和正常胎兒母體血清的差異表達(dá)蛋白，篩選與DS相關(guān)特異的母體血清蛋白新標(biāo)志物，為建立DS早期無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查新方法奠定理論基礎(chǔ)。 方法： 1.血清蛋白的提取取血清樣品離心后，吸取中間層，去除上層油脂。稀釋后濾膜過(guò)濾，然后用Agilent Multiple Affinity Removal

2、Column處理，去除高豐度蛋白。使用超濾管進(jìn)行濃縮除鹽，最后使用Bio-Rad protein assay reagent進(jìn)行蛋白定量，低溫保存?zhèn)溆谩?2.二維凝膠電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)操作步驟參照Gorg等方法和IPGphor等電聚焦系統(tǒng)使用指南進(jìn)行，每組樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，上樣后進(jìn)行等電聚焦和SDS-PAGE二維凝膠電泳，銀染后用干膠儀(Bio-Rad公司)干

3、膠，得到電泳膠片。 3.差異蛋白質(zhì)圖譜的建立染色、干燥后的電泳凝膠用Image scaner掃描儀及Labscan配套掃描軟件進(jìn)行掃描，獲取血清蛋白質(zhì)電泳圖像。然后利用Imagemaster2D Elite4.01分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組和正常組的雙相電泳銀染圖像依次進(jìn)行強(qiáng)度檢測(cè)，背景消減、匹配、1D(維)及2D(維)校正，建立平均凝膠圖像，量化獲取蛋白斑點(diǎn)的灰度值信息，建立差異蛋白質(zhì)圖譜。 4.差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的生物質(zhì)譜分析選取圖

4、像分析得到的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，從凝膠上切取這些點(diǎn)，依次進(jìn)行脫色、脫水、還原、酶解和萃取。樣品與基質(zhì)液充分混合，取混合液點(diǎn)樣于不銹鋼點(diǎn)樣板上，自然風(fēng)干。將點(diǎn)樣板置于質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜。 5.蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)將肽質(zhì)量指紋數(shù)據(jù)在NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索。查詢(xún)參數(shù)：物種分類(lèi)選擇為人類(lèi)；酶選擇為T(mén)rypsin；允許的未酶切位點(diǎn)選擇為1；固定修飾為carbamidomethyl(C)，變量修飾為oxida

5、tion(M)，量誤差為0.5 Da；肽片段容差選擇為100 ppm；離子選擇為MH+和monoiso-tope；選擇直接輸入MascotSearch即可進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。 6.免疫印跡(Western blotting，WB)驗(yàn)證采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，雜交等免疫印記的方法對(duì)篩選出來(lái)的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，得到放射自顯影X光片；光片用可見(jiàn)光/紫外凝膠掃描分析系統(tǒng)(UVP，美國(guó))掃描，再用分析軟件系統(tǒng)(Labworks

6、TM Analysis Software，美國(guó))得出積分光密度表。 結(jié)果： 1.二維凝膠電泳 1.1血清蛋白定量 采用Bradford法對(duì)兩組標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，正常組濃度為26.44μg/Li l，異常組濃度為22.98μg/μl。 1.2.二維凝膠電泳 對(duì)4例正常組母體血清和4例唐氏綜合征實(shí)驗(yàn)組母體血清進(jìn)行了2-DE，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，分別得到正常組和唐氏綜合征胎兒母體血清蛋白質(zhì)電泳膠片，染色膠

7、片上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)清晰可辨，蛋白斑點(diǎn)數(shù)約為612~754之間和648~731之間。圖像顯示實(shí)驗(yàn)組及正常組大部分蛋白斑點(diǎn)均位于分子量15.5~120kD、pl4.0~8.0的區(qū)域，特別是35~85kD、pl4.5～7.5區(qū)域，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)分布密集，表明血清中pH極酸和極堿性蛋白質(zhì)的含量均較少，電泳結(jié)果可靠。 1.3.差異蛋白圖譜建立 用Imagemaster2D Elite4.01軟件分析實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組的2-DE凝膠圖譜，正常組

8、平均檢測(cè)蛋白點(diǎn)684.3±71.0個(gè)，實(shí)驗(yàn)組平均檢測(cè)蛋白點(diǎn)690.0±41.5個(gè)。分別將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的三次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果中斑點(diǎn)位置清晰的圖像進(jìn)行合成處理，得到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的合成凝膠電泳圖譜，并利用軟件進(jìn)行組間蛋白質(zhì)點(diǎn)的兩兩比較，差異值大于1.5倍視為差異顯著。與正常組相比，除已用于DS篩查的標(biāo)志物外，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中特異表達(dá)或表達(dá)顯著升高的蛋白點(diǎn)19個(gè)，表達(dá)降低的蛋白點(diǎn)10個(gè)，即唐氏綜合癥母體血清蛋白較正常胎兒母體血清表達(dá)顯著差異的

9、蛋白點(diǎn)共29個(gè)。 2.差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的生物質(zhì)譜分析 2.1肽質(zhì)量指紋圖在29個(gè)顯著差異蛋白點(diǎn)中選擇灰度值差異倍數(shù)最大的8個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，分別是827，828，830，1565，1724，1773，2199，并獲得其肽質(zhì)量指紋圖。 2.2.差異蛋白質(zhì)點(diǎn)在數(shù)據(jù)庫(kù)中的查詢(xún)結(jié)果在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中，以匹配分值(mowse score)為基礎(chǔ)的概率(P)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋結(jié)果的質(zhì)量，匹配分值的大小表示鑒定蛋白屬于隨機(jī)匹配的可

10、能性，當(dāng)匹配分值達(dá)到或超過(guò)66分時(shí)，待測(cè)蛋白的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中某已知蛋白的氨基酸序列覆蓋率較高，認(rèn)為匹配的可能性很大，共發(fā)現(xiàn)8個(gè)蛋白質(zhì)與之匹配的可能性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些差異蛋白質(zhì)分別是827號(hào)dGTPase，828號(hào)Chain A，F(xiàn)actor B Serine Protease Domain，830號(hào)Beta2-Glycoprotein I，1358號(hào)Complement factor H-related protein1 pr

11、ecursor，1565號(hào)Kininogen1 isoform2，1724號(hào)Chain B，Crig Bound To C3c，1773號(hào)Chain B，Human Complement Component C3c，2199號(hào)Chain A， Crystal Structure of Lipid-Free Human Apolipoprotein A-I。 3.免疫印跡結(jié)果 3.1免疫印跡放射自顯影結(jié)果對(duì)差異表達(dá)的8個(gè)蛋

12、白質(zhì)中的dGTP酶(dGTPase)和β2-糖蛋白I(Beta2-Glycoprotein I)進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)放射自顯影得到X光片。從圖片可以看出DS孕婦血清標(biāo)本dGTP酶和β2-糖蛋白I分子量所在蛋白質(zhì)條帶明顯強(qiáng)于正常孕婦血清標(biāo)本條帶，且內(nèi)參照物Beta-actin在各泳道中的強(qiáng)度一致性較好，證明WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。 3.2自顯影X光片光密度掃描 X光片條帶用分析軟件系統(tǒng)(LabworksTM AnalysisSoft

13、ware，美國(guó))掃描得出對(duì)應(yīng)的積分光密度值，即膠片蛋白帶的灰度值，由此算出條帶蛋白相對(duì)含量。結(jié)果顯示DS孕婦血清標(biāo)本條帶蛋白相對(duì)含量均強(qiáng)于正常孕婦血清標(biāo)本條帶2倍以上，與X光片結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果的正確性。 結(jié)論： 1.采用2-DE技術(shù)建立了DS母體血清和正常胎兒母體血清的差異蛋白圖譜，并篩選獲得了29個(gè)表達(dá)顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中DS母體血清特異表達(dá)或表達(dá)顯著升高的蛋白點(diǎn)有19個(gè)，表達(dá)降低的有10個(gè)

14、。 2.利用生物質(zhì)譜分析技術(shù)建立了差異蛋白質(zhì)的肽指紋圖，通過(guò)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)、鑒定出了8種與DS相關(guān)的母體血清蛋白新標(biāo)志物。 3.應(yīng)用免疫印記方法對(duì)dGTP酶(dGTPase)和β2-糖蛋白I(Beta2-Glycoprotein I)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果dGTPase和Beta2-Glycoprotein I在DS胎兒母體血清中的濃度均顯著高于正常胎兒母體血清，與生物質(zhì)譜分析結(jié)果吻合，進(jìn)一步證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出的