蛋白質(zhì)組學(xué)在篩選肝癌早期診斷血清標(biāo)志物中的應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分應(yīng)用雙向電泳-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分析肝癌血清蛋白質(zhì)組 目的：運用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向凝膠電泳和飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，研究原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者與肝硬化及正常健康個體血清蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜的差異，尋找和確定原發(fā)性肝細(xì)胞癌特征性的血清標(biāo)志物，為肝癌的臨床早期診斷與治療提供實驗室參考依據(jù)。 方法： 收集原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者、肝硬化患者與正常人血清標(biāo)本各25例，血清預(yù)處理除去白蛋白和免疫球蛋白，雙向凝膠電泳的第一向電泳采用固相pH梯

2、度電泳，第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析血清蛋白質(zhì)組成分。電泳后經(jīng)銀染或考馬斯亮藍(lán)染色，ImageMaster雙向凝膠電泳軟件分析，將有意義的差異蛋白質(zhì)點膠內(nèi)胰蛋白酶解，經(jīng)過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS) 分析肽質(zhì)量指紋圖譜，數(shù)據(jù)庫搜索鑒定蛋白質(zhì)。在驗證組血清標(biāo)本(包括26例肝癌、19例肝硬化、25例正常人)和組織標(biāo)本(包括10例肝癌及癌旁組織、6例正常肝組織) 中應(yīng)用Western blottin

3、g 和 RT-PCR 方法進(jìn)行差異蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平的驗證。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對差異蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能分析和預(yù)測。 結(jié)果： 1．原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清與肝硬化及正常健康個體血清相比較，經(jīng)雙向凝膠電泳軟件分析，共找到33個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點，分布在圖譜中的5個區(qū)域內(nèi)。通過數(shù)據(jù)庫檢索分析和鑒定后發(fā)現(xiàn)，同一個區(qū)域的蛋白質(zhì)均為同一種蛋白。與肝硬化和正常人比較，血清白蛋白(去除后的部分殘留)、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、CD5抗原

4、類蛋白(IgM相關(guān)肽)在肝細(xì)胞癌中低表達(dá)，鋅-α2糖蛋白(ZAG)和免疫球蛋白γ-1 鏈C區(qū)在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)。此外，本項研究還對雙向電泳的關(guān)鍵步驟進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，得到了較好的效果。 2．經(jīng)血清免疫印跡驗證分析，肝癌血清中鋅-α2糖蛋白(ZAG)表達(dá)與肝硬化、正常人比較明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。其中，26例ZAG蛋白高表達(dá)的肝癌病例中包括5例AFP陰性(AFP<20ug/L)肝癌患者和6例小肝癌(直徑≤3cm

5、)肝癌患者。肝癌組織的RT-pCR和Western blotting驗證結(jié)果顯示，ZAGmRNA和ZAG 蛋白的表達(dá)在肝癌組織中明顯高于癌旁組織和正常肝組織，以β-actin 作為內(nèi)對照，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3．對鋅-α2糖蛋白的生物信息學(xué)分析顯示，ZAG基因定位于染色體7q22.1，ZAG蛋白為分泌性蛋白，從蛋白序列和結(jié)構(gòu)上看，其結(jié)構(gòu)上有一個和Ⅰ型MHC肽段結(jié)合凹槽相似的大凹槽，在這個凹槽中包含了一種非肽段的化

6、合物，這可能和正常或病理條件下的脂類代謝相關(guān)。ZAG是一種新的脂類動員因子，促進(jìn)降脂作用，在癌性惡病質(zhì)形成中起作用。 小結(jié)： 1．根據(jù)蛋白質(zhì)不同的分子量和等電點，通過雙向凝膠電泳技術(shù)可將人血清中蛋白質(zhì)成分進(jìn)行分離，并可利用分析軟件，找到不同疾病狀態(tài)下血清中的差異蛋白質(zhì)。 2．原發(fā)性肝細(xì)胞癌與肝硬化、正常人相比，在血清蛋白質(zhì)組成分中存在差異。血清白蛋白(去除后的部分殘留)、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、CD5抗原類蛋白(IgM 相

7、關(guān)肽)在肝癌中低表達(dá)，鋅-α2糖蛋白和免疫球蛋白γ-1鏈C區(qū)在肝癌中高表達(dá)。其中，CD5 抗原類蛋白(IgM相關(guān)肽) 和鋅-α2糖蛋白與肝細(xì)胞癌之間的相關(guān)性研究目前尚未見報道。本項研究找到的這些差異蛋白質(zhì)為進(jìn)一步完善原發(fā)性肝細(xì)胞癌血清學(xué)診斷指標(biāo)提供了參考依據(jù)。 3．對鋅-α2糖蛋白的初步驗證結(jié)果提示，其與肝細(xì)胞癌密切相關(guān)，可作為肝癌早期輔助診斷的潛在血清標(biāo)記物和可能存在的治療靶點，值得進(jìn)一步深入研究。 第二部分應(yīng)用SEL

8、DI-TOF MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)分析肝細(xì)胞癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜 目的：運用表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(Surface-enanced laser desorptio/ionization-time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF MS)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測肝細(xì)胞癌患者、肝硬化患者和正常人血清蛋白質(zhì)指紋圖譜表達(dá)差異，篩選肝癌特征性血清標(biāo)志物。為肝癌的臨床早期診斷和藥物靶點篩選提供可

9、靠的、準(zhǔn)確靈敏的實驗室參考指標(biāo)。 方法：應(yīng)用SELDI-TOF MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測肝細(xì)胞癌患者、肝硬化患者和性別、年齡匹配的正常健康人血清各25例，獲得弱陽離子交換(WCX2)蛋白質(zhì)芯片和疏水型(H4)蛋白質(zhì)芯片的蛋白質(zhì)指紋圖譜。用 BioMarker Wizard、Biomarker Pattern 專用軟件分析肝癌和肝硬化及正常人血清的差異蛋白質(zhì)/多肽。用驗證組血清標(biāo)本(26例肝癌、19例肝硬化、25例正常人)對模型進(jìn)行

10、盲法測試驗證，得出判斷模型的靈敏度和特異性。應(yīng)用生物信息學(xué)對差異性蛋白/多肽搜索數(shù)據(jù)庫進(jìn)行初步鑒定。 結(jié)果： 1.應(yīng)用WCX2芯片和H4芯片在肝癌患者、肝硬化和正常人血清中檢測到在不同質(zhì)荷比處分別有六個和四個差異蛋白質(zhì)峰。經(jīng)過BioMarker Wizard軟件分析，質(zhì)荷比(M/Z)為6489Da(P1)、6662Da(P2)、8582Da(P9)、8720Da(P4)、8960Da(P5和P10)處的五個差異蛋白質(zhì)峰在

11、肝癌組明顯低于肝硬化組和正常人組；質(zhì)荷比為5552Da(P7)、7748Da(P8)、7777Da(P3)、9250Da(P6) 處的四個差異蛋白質(zhì)峰在肝癌組明顯高于肝硬化組和正常人組，差異蛋白質(zhì)峰含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2.利用Biomarker Pattern軟件對驗證組70例血清標(biāo)本(包括26例肝癌、19例肝硬化、25例正常人)進(jìn)行盲法測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5552Da、7748Da、7777Da、9250Da 這四個多肽組成的預(yù)

12、測模型能夠?qū)Ω伟┗颊哌M(jìn)行鑒別。靈敏度為92．3％(24/26，其中5例AFP<20ng/ml的肝癌患者中有3例被正確分到肝癌組；6例小肝癌全部被正確分到肝癌組)，特異性為95．5％(42/44)。 3．對篩選出的差異多肽進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索分別得到了與之分子量最為接近的多肽，分別為：P1：Galantn 相關(guān)肽，P2：Neuregulin-4，P3：小誘導(dǎo)細(xì)胞因子CCL-15，P4：CSL-型鋅指包涵蛋白，P5和P10：ATP合酶偶聯(lián)

13、因子6，P6：泛醌-細(xì)胞色素C還原酶復(fù)合物線粒體前體，P7：轉(zhuǎn)化生長因子-α前體，P8：成熟T細(xì)胞增殖因子-1型A，P9：載脂蛋白 A-Ⅱ前體。 小結(jié)： 1. 應(yīng)用SELDI-TOF MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)篩選肝癌患者血清特異性生物標(biāo)志物的方法快速、有效，操作自動化。建立的診斷模型預(yù)測肝癌的靈敏度為92.3％，特異性為95.5％，優(yōu)于現(xiàn)有AFP和B超等診斷指標(biāo)。 2. 檢測到的這九種差異蛋白質(zhì)/多肽可能參與了肝癌的發(fā)

14、生、發(fā)展過程，有可能成為治療肝癌的候選藥物靶點。 3. SLEDI-TOF MS蛋白芯片技術(shù)用于分析血清蛋白質(zhì)組成分的方法靈敏度和特異性均較高，有望成為臨床上腫瘤早期診斷的重要檢測方法。 綜合以上兩部分的研究結(jié)論： 1. 應(yīng)用血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，尋找可用作肝癌早期診斷或治療靶點的新的血清標(biāo)志物，這樣的研究思路是可行的。 2. 應(yīng)用雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，分析了肝癌、肝硬化和正常人各25例血清標(biāo)本，血清白

15、蛋白(去除后的部分殘留)、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、CD5抗原類蛋白(IgM相關(guān)肽) 在肝癌中低表達(dá)，鋅-α2糖蛋白和免疫球蛋白γ-1鏈C區(qū)在肝癌中高表達(dá)。鋅-α2糖蛋白基因定位于染色體7q22.1，蛋白為分泌性蛋白，與Ⅰ型MHC有高度相似性結(jié)構(gòu)，是一種新的脂類動員因子，促進(jìn)降脂作用，在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制有待進(jìn)一步研究。 3. 應(yīng)用SELDI-TOF MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)分析了肝癌、肝硬化和正常人各25例血清標(biāo)本，肝癌組在質(zhì)荷比為64

16、89Da、6662Da、8582Da、8720Da、8960Da處的五個蛋白質(zhì)峰明顯減低；肝癌組在質(zhì)荷比為5552Da、7748Da、7777Da、9250Da處的四個蛋白質(zhì)峰明顯升高。應(yīng)用 5552Da、7748Da、7777Da、9250Da這四個組成的預(yù)測模型能夠?qū)Ω伟┗颊哌M(jìn)行鑒別，靈敏度為92.3％，特異性為95.5％，優(yōu)于現(xiàn)有AFP和B超等診斷指標(biāo)。通過數(shù)據(jù)庫搜索，初步鑒定了九種差異多肽。 4.通過雙向電泳和SELDI

17、-TOF MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)研究血清蛋白質(zhì)組成分差異，兩種方法各有優(yōu)點和不足。雙向電泳方法篩選到的差異蛋白質(zhì)為分子量中等大小的蛋白質(zhì)(10KD